人脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1）誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞(hunan adipose derived stem cells，hASCs)向平滑肌細(xì)胞分化并鑒定;
　　2）探討miR-145在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)及作用;
　　3）預(yù)測(cè)miR-145的作用靶基因，并確定miR-145及其靶基因?qū)ASCs向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制;
　　4）闡明鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱγ（Ca2+/calmodulin-dep

2、endent protein kinaseⅡγ，CaMKⅡγ）在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)與作用機(jī)制。
　　方法:
　　1）分離培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞并鑒定;將第三代hASCs在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和骨形態(tài)蛋白4(BMP4)的作用下向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，用熒光定量PCR、western blot、免疫熒光等方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá);
　　2）hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天以后檢測(cè)miR-1

3、45的表達(dá)情況;合成miR-145模擬物及抑制物，并將其轉(zhuǎn)染到hASCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功以后進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)，并確定miR-145在這過(guò)程中的作用;
　　3）利用生物學(xué)信息查詢初步預(yù)測(cè)miR-145的靶基因，經(jīng)過(guò)熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、miR-145的過(guò)表達(dá)及被抑制試驗(yàn)，確定miR-145與靶基因之間的作用關(guān)系;檢測(cè)靶基因在hASCs向平滑肌誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá);合成miR-145的靶基因的siRNA干擾載

4、體并轉(zhuǎn)染到hASCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)并檢測(cè)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá);
　　4）hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)后檢測(cè)CaMKⅡγ表達(dá)。合成CaMKⅡγ的過(guò)表達(dá)載體及沉默載體轉(zhuǎn)染到hASCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行誘導(dǎo)并利用熒光定量PCR、western blot、免疫熒光等方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)，確定CaMKⅡγ對(duì)hASCs向平滑肌細(xì)胞分化中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1)

5、第三代hASCs在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)成纖維樣形態(tài)，CD13、CD34、CD44、CD49d、CD90、CD105以及CD166陽(yáng)性表達(dá)，而造血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD14、CD45與CD31陰性表達(dá);hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天后，具有平滑肌細(xì)胞特有的“波峰-波谷”樣生長(zhǎng)特點(diǎn)。表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物:a-SMA，SM22a，calponin及SM-MHC;
　　2）hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天以后miR-145的表達(dá)逐

6、漸增高。miR-145轉(zhuǎn)染到細(xì)胞以后平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)明顯增高，而miR-145被抑制以后結(jié)果相反;
　　3）利用生物學(xué)信息查詢及文獻(xiàn)閱讀，初步定KLF-4為miR-145在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化中的靶基因，并被熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)結(jié)果所確定。KLF-4在hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)逐漸下降。KLF-4被miR-145抑制，而miR-145被抑制以后KLF-4的表達(dá)增高。在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中抑制

7、KLF-4導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)增高;
　　4）在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中CaMKⅡγ的表達(dá)明顯增高。CaMKⅡγ過(guò)表達(dá)使平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)增高，而沉默CaMKⅡγ使hASCs向平滑肌分化被抑制。
　　結(jié)論:
　　1）hASCs獲取方便，在普通培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，并能維持干細(xì)胞的特性，能作為組織工程研究及應(yīng)用的首選種子細(xì)胞;
　　2）TGF-β1和BMP4能使hASCs向平滑肌細(xì)胞分化