microRNa-214通過(guò)靶向作用QKI調(diào)控干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化研究.pdf

1、目的:
　　以動(dòng)脈粥樣硬化為基本組織病理改變的血管損傷性病變，其基本病理進(jìn)程為:血管損傷引起血管修復(fù)和重塑，繼而血管內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致管腔狹窄。在這一病變過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞通過(guò)表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移以及干細(xì)胞分化兩種方式參與其中。
　　既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microRNA-214(miR-214)調(diào)控成熟血管平滑肌細(xì)胞功能和表型轉(zhuǎn)換，然而對(duì)于其在干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化中的作用尚不是十分清楚。本研究希望揭示miR-214在胚胎干

2、細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化中的作用，鑒定miR-214的靶基因，闡明其作用機(jī)制。
　　方法:
　　本研究主要利用課題組前面建立的、穩(wěn)定的、體外的小鼠胚胎干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化模型，觀察miR-214表達(dá)變化，并過(guò)表達(dá)或抑制miR-214表達(dá)，研究miR-214對(duì)胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的作用。其次，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析及螢光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)等多種方法鑒定及確認(rèn)miR-214的功能性靶基因。再者，利用免疫共沉淀(IP)、

3、雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)等多種分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)，證明QKI對(duì)胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的作用及作用途徑。最后，利用體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞打入動(dòng)物體內(nèi)模擬在體環(huán)境的小鼠胚胎干細(xì)胞分化模型，研究miR-214對(duì)胚胎干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:
　　利用課題組以前建立的模型，小鼠胚胎干細(xì)胞在CollagenⅣ的刺激下能夠穩(wěn)定的分化成血管平滑肌細(xì)胞，并且隨著時(shí)間的推移，平滑肌標(biāo)志基因(SM-22α、SM-MHC、 h1-Calp

4、onin)等表達(dá)增多。在此過(guò)程中，miR-214表達(dá)顯著上升趨勢(shì)。在功能研究實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-214能夠顯著促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而抑制miR-214表達(dá)則降低平滑肌標(biāo)志基因的表達(dá)。多個(gè)miRNA的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)分析軟件預(yù)測(cè)QKI是miR-214最有可能的的靶基因之一。在分化中的小鼠胚胎干細(xì)胞上，過(guò)表達(dá)miR-214能夠在mRNA和蛋白水平下調(diào)QKI表達(dá)，而抑制miR-214引起QKI表達(dá)水平升

5、高。熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-214能夠顯著降低含有QKI3'UTR的熒光素酶活性，抑制miR-214能夠相應(yīng)引起QKI3'UTR的熒光素酶活性在一定程度上升高。而對(duì)QKI3'UTR中miR-214潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變后，miR-214對(duì)熒光素酶活性的抑制作用消失。miR-214過(guò)表達(dá)模擬物和QKI過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)QKI可消除過(guò)表達(dá)的miR-214對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。同時(shí)，分別

6、過(guò)表達(dá)和抑制QKI，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)QKI能夠降低血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志基因的mRNA和蛋白表達(dá)，抑制QKI表達(dá)則具有相反的作用。進(jìn)而，IP顯示，QKI能夠直接結(jié)合在平滑肌細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列。最后，在成功建立的小鼠胚胎干細(xì)胞在體分化模型中，發(fā)現(xiàn)miR-214能夠促進(jìn)平滑肌分化標(biāo)志基因的表達(dá)，在一定程度上從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證了miR-214促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:
　　本研究成功揭示了miR-214