microRNa-214通過靶向作用QKI調(diào)控干細胞向血管平滑肌細胞分化研究.pdf

1、目的:
　　以動脈粥樣硬化為基本組織病理改變的血管損傷性病變，其基本病理進程為:血管損傷引起血管修復(fù)和重塑，繼而血管內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致管腔狹窄。在這一病變過程中，血管平滑肌細胞通過表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移以及干細胞分化兩種方式參與其中。
　　既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microRNA-214(miR-214)調(diào)控成熟血管平滑肌細胞功能和表型轉(zhuǎn)換，然而對于其在干細胞向血管平滑肌細胞分化中的作用尚不是十分清楚。本研究希望揭示miR-214在胚胎干

2、細胞向血管平滑肌細胞分化中的作用，鑒定miR-214的靶基因，闡明其作用機制。
　　方法:
　　本研究主要利用課題組前面建立的、穩(wěn)定的、體外的小鼠胚胎干細胞向平滑肌細胞分化模型，觀察miR-214表達變化，并過表達或抑制miR-214表達，研究miR-214對胚胎干細胞向血管平滑肌細胞分化的作用。其次，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析及螢光素酶基因報告系統(tǒng)等多種方法鑒定及確認miR-214的功能性靶基因。再者，利用免疫共沉淀(IP)、

3、雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)等多種分子實驗技術(shù)，證明QKI對胚胎干細胞向血管平滑肌細胞分化的作用及作用途徑。最后，利用體外轉(zhuǎn)染的細胞打入動物體內(nèi)模擬在體環(huán)境的小鼠胚胎干細胞分化模型，研究miR-214對胚胎干細胞向平滑肌細胞分化的影響。
　　結(jié)果:
　　利用課題組以前建立的模型，小鼠胚胎干細胞在CollagenⅣ的刺激下能夠穩(wěn)定的分化成血管平滑肌細胞，并且隨著時間的推移，平滑肌標(biāo)志基因(SM-22α、SM-MHC、 h1-Calp

4、onin)等表達增多。在此過程中，miR-214表達顯著上升趨勢。在功能研究實驗中，過表達miR-214能夠顯著促進血管平滑肌細胞標(biāo)志基因在mRNA和蛋白水平的表達，而抑制miR-214表達則降低平滑肌標(biāo)志基因的表達。多個miRNA的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫分析軟件預(yù)測QKI是miR-214最有可能的的靶基因之一。在分化中的小鼠胚胎干細胞上，過表達miR-214能夠在mRNA和蛋白水平下調(diào)QKI表達，而抑制miR-214引起QKI表達水平升

5、高。熒光素酶基因報告實驗表明，過表達miR-214能夠顯著降低含有QKI3'UTR的熒光素酶活性，抑制miR-214能夠相應(yīng)引起QKI3'UTR的熒光素酶活性在一定程度上升高。而對QKI3'UTR中miR-214潛在結(jié)合位點進行突變后，miR-214對熒光素酶活性的抑制作用消失。miR-214過表達模擬物和QKI過表達質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)高表達QKI可消除過表達的miR-214對小鼠胚胎干細胞向血管平滑肌細胞分化的促進作用。同時，分別

6、過表達和抑制QKI，發(fā)現(xiàn)過表達QKI能夠降低血管平滑肌細胞標(biāo)志基因的mRNA和蛋白表達，抑制QKI表達則具有相反的作用。進而，IP顯示，QKI能夠直接結(jié)合在平滑肌細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的啟動子序列。最后，在成功建立的小鼠胚胎干細胞在體分化模型中，發(fā)現(xiàn)miR-214能夠促進平滑肌分化標(biāo)志基因的表達，在一定程度上從體內(nèi)實驗層面驗證了miR-214促進鼠胚胎干細胞向血管平滑肌細胞分化。
　　結(jié)論:
　　本研究成功揭示了miR-214