小豆蔻明靶向作用于mTOR抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、[研究背景及目的] 胰島素抵抗(InsulinResistance，IR)是糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，常引起中央或外周血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致血管張力的異常增加以及血管平滑肌細(xì)胞(VascularSmoothMuscularCells，VSMCs)的異常增殖。因此，改善IR，逆轉(zhuǎn)或抑制VSMCs增殖是防治血管增殖性疾病的重要措施。 哺乳類(lèi)雷帕霉素靶蛋白(MammalianTargetOfRa

2、pamycin，mTOR)為胰島素(Insulin，Ins)信號(hào)通路中的重要分子，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)起始翻譯、核糖體生物合成及細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)效應(yīng)，是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中極為重要的靶標(biāo)。研究表明，血管增殖性疾病、代謝綜合癥等諸多疾病的發(fā)生發(fā)展均與mTOR的表達(dá)及功能改變有關(guān)。常用的抗排斥藥物雷帕霉素(Rapamycin，RAP)為mTOR特異性抑制劑，能夠抑制VSMCs增殖，提示mTOR可能成為防治血管增殖性病變的重要靶標(biāo)。然而，RAP

3、主要用于抗移植排異，不良反應(yīng)較多，限制全身性應(yīng)用。中藥資源豐富，基于mTOR篩選抑制抗增殖的中藥有效成分的研究，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)。因此，以mTOR為靶標(biāo)改善IR所致血管病變的藥物研發(fā)具有廣闊前景。 小豆蔻明(Cardamonin，Car)為豆蔻屬植物中的查爾酮類(lèi)單體，化學(xué)結(jié)構(gòu)為2，4-雙羥基-6’甲氧基查爾酮。研究顯示，Car具有心血管保護(hù)作用，能明顯舒張血管。目前，Car在IR狀態(tài)下對(duì)VSMCs增殖影響的研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。本研究以

4、高糖高胰島素模擬IR狀態(tài)培養(yǎng)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HumanUmbilicalArterySmoothMuscleCells，HUASMCs)，探討Car對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)HUASMCs增殖的影響，通過(guò)檢測(cè)mTOR及其結(jié)合蛋白R(shí)aptor、Rictor的mRNA表達(dá)，深入探討Car抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，同時(shí)考察Car免疫抑制活性，為尋找改善IR、治療血管增殖性病變的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法] 1.細(xì)胞培養(yǎng) 采用

5、組織貼塊法培養(yǎng)原代HUASMCs，傳代細(xì)胞分別用含10％小牛血清的正常RPMI1640培養(yǎng)基和高糖高胰島素模擬IR培養(yǎng)基(含2.5mol·L-1葡萄糖和100U·L-1胰島素的RPMI1640培養(yǎng)基)在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 采用密度梯度離心法分離健康人外周血淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞用含10％小牛血清的正常RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.分組與給藥 HUASMC

6、s按正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)后，分別設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、PD98059(3×10-5mol·L-1)組、PD98059+LY294002(10-5mol·L-1)組、PD98059+LY294002+PA(10-4mol·L-1)組、RAP(10～mol·L-1)組及Car(10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)組。 人淋巴細(xì)胞按正常培養(yǎng)及PHA(5mg·

7、L-1)刺激培養(yǎng)后，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、PHA組、陽(yáng)性藥物RAP及CsA(10-1mol·L-1、10-5mol·L-1)對(duì)照組、Car(10-7mol·L-1、3×10-7mol·L-1、10-6mol·L-1、3×10-6mol·L-1、10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)組。 3.測(cè)定指標(biāo) 經(jīng)不同試藥處理3d，用不含細(xì)胞的培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，MTT法(λ=490nm)測(cè)定HUASMC

8、s增殖。采用ELISA法測(cè)定人淋巴細(xì)胞分泌的IL-2水平。利用Trizol試劑，一步法提取HUASMCs總RNA，經(jīng)Real-timePCR擴(kuò)增mTOR、Raptor和Rictor，以β-actin作內(nèi)參，采用Livak法計(jì)算mRNA表達(dá)量。 [結(jié)果] 1.高糖高胰島素培養(yǎng)基較正常培養(yǎng)基明顯促進(jìn)HUASMCs的增殖(0.545±0.028vs0.422±0.047，P<0.01)。對(duì)于正常及模擬IR培養(yǎng)的HUASMCs，

9、10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1Car對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，高劑量Car(10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)。PD98059抑制HUASMCs增殖，RAP及Car(10-4mol·L-1)能加強(qiáng)該作用(P<0.05，P<0.01)。同時(shí)加入PD98059及LY294002，并進(jìn)一步采用PA誘導(dǎo)HUASMCs增殖，該作用可被RAP及高低劑量Car(10-6mol·

10、L-1、10-4mol·L-1)所阻斷(P<0.05,P<0.01)，且高劑量Car作用較RAP對(duì)照更為顯著(P<0.01)。 2.預(yù)先給予PD98059，RAP及Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)能明顯降低正常培養(yǎng)及模擬IR狀態(tài)下HUASMCs中mTORmRNA的表達(dá)。RAP、Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)對(duì)正常培養(yǎng)的HUASMCs中RaptormRNA的表達(dá)均具有抑制作用。對(duì)于

11、模擬IR培養(yǎng)的HUASMCs，RAP、Car(10-5mol·L-1)則呈促進(jìn)作用。在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，RAP對(duì)HUASMCs中RictormRNA的表達(dá)具有抑制作用，Car(10-6mol·L-1、10-5mol·L-1)作用相反，表現(xiàn)為促進(jìn)表達(dá)；在模擬IR狀態(tài)下，RAP、Car(10-5mol·L-1)均對(duì)RictormRNA的表達(dá)呈促進(jìn)作用。 同時(shí)加入PD98059及LY294002，PA可明顯促進(jìn)HUASMCs中mTORm

12、RNA的表達(dá)，且RAP、Car(10-5mol·L-1)可抑制該作用，Car(10-6mol·L-1)對(duì)mTORmRNA的表達(dá)無(wú)影響。在兩種培養(yǎng)模式下，使用PD98059和LY294002后，Raptor及RictormRNA的含量顯著降低。利用PA刺激，二者mRNA表達(dá)顯著增加。RAP對(duì)正常培養(yǎng)狀態(tài)下Raptor及RictormRNA的表達(dá)具有促進(jìn)作用，但在IR狀態(tài)下則表現(xiàn)為相反作用。Car(10-5mol·L-1)對(duì)二者的表達(dá)不論是

13、在正常還是模擬IR狀態(tài)下，均呈現(xiàn)抑制作用。 3.PHA可增加人淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)IL-2分泌(10.400±0.582vs15.575±0.794，P<0.01)。Car對(duì)正常培養(yǎng)及PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活性呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，Car(10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1)不明顯影響IL-2分泌。 [結(jié)論] 低劑量Car對(duì)血清誘導(dǎo)正常及模擬IR狀態(tài)培養(yǎng)的HuASMCs無(wú)影響，而高劑量抑制增殖。在模擬胰島素