bFGF在煙草煙霧誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素，對(duì)于人類在心血管方面的危害超過(guò)了吸煙導(dǎo)致的肺癌。我國(guó)是世界上煙草消耗最大的國(guó)家，國(guó)人60％男性和3％女性吸煙，吸煙者大約有3.5億人。吸煙對(duì)人類健康的危害是巨大的，2000年世界上有169萬(wàn)人因吸煙死于心血管疾病，占全球心血管疾病死亡人數(shù)的11％，2002年有500萬(wàn)人的死亡是由吸煙引起的，而我國(guó)每年有120萬(wàn)人因吸煙導(dǎo)致死亡。
　　 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic Fibroblast G

2、rowth Factor，bFGF）是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族成員之一，在體內(nèi)分布廣泛。bFGF具有多種生物學(xué)特性，促進(jìn)細(xì)胞增殖是其主要作用之一。而血管平滑肌細(xì)胞增殖（vascular smooth muscle cell，VSMC）是動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和肺動(dòng)脈高壓等多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)。
　　 本研究應(yīng)用煙草煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激體外培養(yǎng)的大鼠VSMC，觀察其對(duì)大鼠VSMC增

3、殖的影響并應(yīng)用bFGF抗體中和bFGF生物功能，探討bFGF在CSE刺激VSMC增殖中的作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 細(xì)胞在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2天換液1次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80％左右時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。取第3～8代的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70％～80％融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)分組
　　 1、用不同濃度（0，2.5％

4、，5％，10％，20％）CSE刺激VSMC，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）觀察細(xì)胞增殖變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定bFGF和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達(dá)，同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)bFGF mRNA表達(dá)。
　　 2、用篩選出的最適CSE濃度處理VSMC不同時(shí)間（0h，4h，8h，12h，24h）后，檢測(cè)bFGF mRNA，bFGF和PCNA蛋白

5、的變化。
　　 3、用bFGF抗體和最適濃度CSE干預(yù)VSMC 24h后檢測(cè)細(xì)胞增殖，bFGF和PCNA蛋白表達(dá)的變化。
　　 三、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法
　　 噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]比色法測(cè)定VSMC的增殖；用免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定bFGF、PCNA蛋白的表達(dá)；用RT-PCR檢測(cè)bFGF mRNA表達(dá)的變化。

6、
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、與對(duì)照組相比，低濃度（2.5％）CSE組（P<0.05）和中濃度（5％）CSE組增加明顯P<0.01），而高濃度（10％CSE）或過(guò)高濃度（20％CSE）組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性（P>0.05）。bFGF mRNA、蛋白和PCNA蛋白在對(duì)照組中有少量表達(dá)。與對(duì)照組相比，2.5％CSE組表達(dá)增加（P<0.01），5％CSE組達(dá)到高峰。10％、20％CSE組仍高于對(duì)照組（P<0.01）。

7、>　　 2、對(duì)照組（不加CSE組即0h組）VSMC中有少量bFGF mRNA、蛋白和PCNA蛋白表達(dá)。5％CSE刺激4h后細(xì)胞內(nèi)bFGF mRNA、蛋白和PCNA蛋白表達(dá)增加（P<0.01），bFGF mRNA于8h達(dá)高峰；bFGF和PCNA蛋白于12h達(dá)高峰。
　　 3、bFGF抗體可顯著抑制5％CSE誘導(dǎo)的MTT吸光度（A值）和bFGF、PCNA蛋白表達(dá)增加。
　　 結(jié)論：
　　 CSE可能是通過(guò)增加bFG