自噬對血管平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、目的：探討自噬作用與血管平滑肌細胞(VSMC)增殖之間的關系。為防治VSMC異常增殖提供新的理論依據。
　　 實驗方法：用健康SD大鼠的腹主動脈進行VSMC的原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為5％CO2、37℃。培養(yǎng)3～5天有細胞爬出，7～9天左右可進行第一次傳代。根據檢測方法的不同可分為：①用于免疫細胞化學檢測的細胞接種于放有小圓玻片的24孔板內，細胞按5×104個/ml細胞密度，每孔1ml。

2、②用于免疫印跡檢測的細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，細胞按5×105個/ml細胞密度，每瓶3ml。實驗選用3～6代VSMC，VSMC傳代后靜置培養(yǎng)16 h，等細胞完全貼壁后換用含0．5％FBS的DMEM培養(yǎng)24 h進行同步化處理(使所有細胞處于細胞周期的靜止期)，隨后分為七個組：①對照組；②雷帕霉素(RPM)組(10 ng/ml)；③3—甲基腺嘌呤(3—MA)組(10 ng/ml)：④凝血酶(F2)組(1 U/ml)；⑤雷帕霉素(10 ng

3、/ml)+凝血酶組(1 U/ml)；⑥3—MA(10 ng/ml)+凝血酶組(1U/ml)；⑦雷帕霉素(10 ng/ml)+胃酶抑素(Pep)組(0．01μ mol/ml)。不同藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過免疫細胞化學、免疫印跡方法檢測各組VSMC的增殖細胞核抗原(PCNA)和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的表達變化。
　　 結果：
　　 一．自噬對VSMC增殖的影響
　　 實驗分別用雷帕霉素和3—MA作用VS

4、MC，用免疫細胞化學和Western Blot方法檢測PCNA、LC3表達變化，結果表明：雷帕霉素作用VSMC后與對照組相比能明顯抑制其增殖(P<0．01)，而3—MA則促進VSMC增殖(P<0．01)。
　　 Western Blot檢測PCNA蛋白表達結果進一步表明F2能促進平滑肌細胞的增殖，但與雷帕霉素共同作用時，F2的促平滑肌增殖作用大大降低(P<0．01)，3—MA與F2共作用時有促VSMC增殖作用。
　　 二

5、．增殖因素(F2)對VSMC自噬與增殖的影響
　　 凝血酶(F2)是促VSMC增殖劑，在VSMC中加入F2后LC3表達有所降低，PCNA的表達明顯上調；F2與雷帕霉素共同作用時，LC3的表達明顯上升，而PCNA則顯著下調；但與單獨使用雷帕霉素組相比LC3的表達量又有一定降低，F2與3—MA同時作用時，自噬被抑制，而PCNA明顯上調，與單獨使用3—MA的組相比LC3的表達量也有一定降低。
　　 三．自噬抑VSMC增殖的機制

6、研究
　　 實驗選用胃酶抑素抑制溶酶體途徑，檢測LC3、PCNA的表達變化，結果發(fā)現，胃酶抑素與雷帕霉素共同作用時，LC3表達上調，而PCNA的表達與雷帕霉素組相比明顯上調，與3—MA組相比PCNA表達更顯著。
　　 結論：
　　 1、雷帕霉素的抑VSMC作用與自噬激活有關，自噬作用能抑制VSMC增殖。
　　 2、促進細胞增殖因素(F2)有降低自噬水平的作用，但效果不顯著。
　　 3、自噬抑VSM