血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義及siRNA-TLR4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的影響.pdf

1、第一部分：血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá) 目的：研究血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)及在脂多糖(LPS)作用下的表達(dá)變化特點(diǎn)。 方法：培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，傳到7～9代。不同濃度LPS作用于HASMCs 24小時(shí)；10ng/ml LPS作用于HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h和48h。應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)LPS不同作用條件下TLR4 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2、免疫熒光檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法測(cè)定LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達(dá)量的變化；流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測(cè)LPS不同作用條件下TLR4蛋白表達(dá)量的變化。 結(jié)果： 1．正常情況下，人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)少量TLR4 mRNA。LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)； TLR4 mRNA在LPS作用下發(fā)生時(shí)間和劑量依賴性變化。 2．正常情況下，人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)少量TLR4

3、蛋白。LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)；受體TLR4蛋白在LPS作用下發(fā)生時(shí)間和劑量依賴性變化。 結(jié)論：人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)TLR4；LPS調(diào)節(jié)HASMCs TLR4表達(dá)，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4的表達(dá)發(fā)生時(shí)間和劑量依賴性變化。 第二部分：血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義 目的：研究血管平滑肌細(xì)胞TLR4的表達(dá)意義。 方法：培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，傳到7～9代。10n

4、g/ml LPS作用于HASMCs 24h。應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR產(chǎn)物。Western blot法測(cè)定10ng/ml LPS作用24小時(shí)后，MMP-2，9蛋白表達(dá)量的變化。明膠酶譜法測(cè)定MMP-2，9活性。EMSA法測(cè)定動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞核因子-кB(NF-кB)的結(jié)合活性?？故荏wTLR4抗體抑制LPS激活受體TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽抑制NF-кB的結(jié)合活性。 結(jié)果： 1．L

5、PS通過其受體TLR4調(diào)節(jié)MMP-9 mRNA的表達(dá)，而對(duì)MMP-2 mRNA表達(dá)無影響。 2．LPS上調(diào)的MMP-9 mRNA能夠翻譯表達(dá)更多量的MMP-9蛋白；而對(duì)MMP-2蛋白的表達(dá)無影響。 3．LPS通過其受體TLR4使血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-9表達(dá)增加的同時(shí)，使MMP-9酶解活性相應(yīng)增加；而LPS對(duì)MMP-2的酶解活性也沒有產(chǎn)生影響。 4．LPS能夠通過其受體TLR4影響血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-кB的結(jié)合

6、活性。 5．受體TLR4依賴NF-кB激活途徑調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)及活性。 結(jié)論：LPS通過TLR4-NF-кB途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及其活性；而激活受體TLR4對(duì)MNIP-2 mRNA和蛋白表達(dá)及其活性無影響。 第三部分： siRNA-TLR4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的影響 目的：研究siRNA-TLR4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的影響。 方法：培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HAS

7、MCs)，傳到7～9代。應(yīng)用Lipofectamine<'TM>2000轉(zhuǎn)染siRNA-TLR4。MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA后TLR4 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后TLR4蛋白表達(dá)變化。Lipofectamine<'TM>2000轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于HASMCs 24h，應(yīng)用瓊脂糖電泳鑒定基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMPs

8、)RT-PCR產(chǎn)物；Western blot法測(cè)定10ng/ml LPS作用24小時(shí)后，MMP-2，9蛋白表達(dá)量的變化；明膠酶譜法測(cè)定MMP-2，9活性。 結(jié)果： 1．轉(zhuǎn)染的siRNA序列本身不會(huì)對(duì)細(xì)胞生存率產(chǎn)生影響，同時(shí)也說明siRNA序列本身是安全的。 2．3個(gè)不同序列siRNA對(duì)血管平滑肌細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的抑制效率不同，以TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRN

9、A-1明顯抑制LPS對(duì)MMP-9 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，而對(duì)MMP-2的表達(dá)無影響。單獨(dú)轉(zhuǎn)染siRNA-1對(duì)MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)都沒有影響。 4．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，而對(duì)MMP-2的表達(dá)無影響。單獨(dú)轉(zhuǎn)染siRNA-1對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)都沒有影響。 5．轉(zhuǎn)染TLR4基因siRNA-1明顯抑制LPS對(duì)MMP-9酶活性的上調(diào)作用，而對(duì)MMP-