高磷對大鼠血管平滑肌細(xì)胞膠原表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的:本研究通過β-甘油磷酸體外處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，觀察其對血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膠原表達(dá)的誘導(dǎo)，進(jìn)一步探討高磷對大鼠血管平滑肌鈣化的影響。以高磷為切入點(diǎn)，觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞分化過程的動態(tài)變化特點(diǎn)并探討其相關(guān)的分子機(jī)制，用不同的實(shí)驗(yàn)方法研究高磷刺激下血管平滑肌細(xì)胞各膠原的不同表達(dá)，從而為慢性腎臟病患者中心血管疾病高發(fā)病率原因的研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，幫助臨床防治尿毒癥心血管事件的發(fā)生及新藥的開發(fā)。
　　 方法:<

2、br>　　 1.選擇SD雄性大鼠，無菌條件下取胸主動脈，原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞鑒定
　　 2.1 雙目倒置相差顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)
　　 2.2 用SABC法對傳代的細(xì)胞進(jìn)行A-平滑肌肌動蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
　　 3.高磷刺激對平滑肌細(xì)胞增殖的影響觀察以不同濃度的β-甘油磷酸（10mmol/Lβ-甘油磷酸、15mmol/Lβ-甘油磷酸、20mmol/Lβ-甘油磷酸）處理平滑肌細(xì)胞

3、，MTT法測定細(xì)胞增殖，與空白對照組比較，觀察高磷刺激對平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　 4.高磷刺激對平滑肌細(xì)胞膠原表達(dá)的影響以β-甘油磷酸(10mmol/L)處理平滑肌細(xì)胞，分別留取0、3、6、9天的細(xì)胞提取RNA，RT-PCR檢測Ⅰ，Ⅱ，Ⅹ型膠原mRNA的表達(dá)情況，并與空白對照組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 1.1 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
　　 1.1.1 細(xì)胞鑒

4、定:雙目倒置相差顯微鏡下，VSMCs為梭形細(xì)胞，呈典型的谷-峰狀生長。
　　 1.1.2 用SABC法對傳代的細(xì)胞進(jìn)行A-平滑肌肌動蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色在高倍鏡下可以見到胞核用蘇木素復(fù)染后呈淡藍(lán)色，卵圓形居中，胞質(zhì)內(nèi)有大量棕色與細(xì)胞長軸平行的平滑肌肌動蛋白絲。
　　 1.2 不同濃度高磷刺激平滑肌細(xì)胞觀察其增殖結(jié)果(MTT結(jié)果)MTT法檢測血管平滑肌細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，10mmol/Lβ-甘油磷酸組細(xì)胞增殖情況（0.304

5、±0.005）和15mmol/Lβ-甘油磷酸組細(xì)胞增殖情況（0.264±0.005）明顯高于空白對照組（0.203±0.010）(P＜0.05)，20mmol/Lβ-甘油磷酸組細(xì)胞增殖情況（0.202±0.101）與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);10mmol/Lβ-甘油磷酸組細(xì)胞增殖情況與15mmol/Lβ-甘油磷酸組細(xì)胞增殖情況相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.3 高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)

6、結(jié)果PCR電泳高磷組Ⅰ型膠原表達(dá)3d（0.932±0.114）、6d(0.715±0.009)、9d（0.652±0.051）高于空白對照組（0.351±0.089），4組之間比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);6d（0.715±0.009）低于3d（0.932±0.114），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);9d（0.652±0.051）明顯低于3d（0.932±0.114），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、＜0.05)。結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原基因表達(dá)在第三天升高并達(dá)到高峰，第六天、第九天與第三天相比有所下降，但都高于空白對照組。
　　 1.4 高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)結(jié)果PCR電泳顯示高磷組Ⅱ型膠原蛋白基因表達(dá)3d（1.071±0.102）低于空白對照組（1.812±0.066）(P＜0.05)，6d（2.035±0.087）高于空白對照組（1.812±0.066）(P＜0.05)，6d（2.035±0.087）明顯高于3

8、d（1.071±0.102）(P＜0.05)。結(jié)果顯示:高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)第六天升高。
　　 1.5 高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅹ型膠原的表達(dá)結(jié)果PCR電泳顯示高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅹ型膠原表達(dá)3d（0.802±0.066）高于空白對照組Ⅹ型膠原表達(dá)（0.677±0.035），2組之間比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);9d（0.521±0.045）明顯高于空白對照組(0.677±0.035)，2組之間比較差異

9、有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);6d（0.627±0.091）與空白對照組（0.677±0.035）比較，2組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3d(0.802±0.066)明顯高于9d（0.521±0.045），兩組之間比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示:高磷刺激血管平滑肌細(xì)胞Ⅹ型膠原表達(dá)于第三天升高并達(dá)到高峰，隨著時(shí)間的推移，其膠原表達(dá)有所下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法成