高鎂通過調(diào)節(jié)BMP-2抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用研究.pdf

1、目的：血管鈣化，多年來已被認(rèn)為是終末期腎臟病患者的一個(gè)常見并發(fā)癥，它是導(dǎo)致終末期腎臟病患者心血管疾?。–VD）發(fā)生率及死亡率增加的重要原因。而最近的體外研究顯示[1]，鎂離子可以減輕血管鈣化，但潛在機(jī)制仍不明確。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)高鎂可在一定程度上抑制高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化，其可能機(jī)制是通過降低VSMCs中骨源性相關(guān)因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，還有研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化過程與生理骨骼礦化有許多相似之處，是有組織

2、的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程，涉及許多促進(jìn)和抑制鈣化因素。其中骨形成蛋白（BMPs）在促進(jìn)血管鈣化形成中扮演著重要的角色。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenic protein-2，BMP-2)是目前研究最廣泛，也是公認(rèn)的BMP家族中成骨活性最強(qiáng)的亞型[3]。因此，本研究以VSMCs鈣化為模型，研究高鎂對(duì)VSMCs成骨相關(guān)因子-骨形成蛋白2（BMP-2）表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)方法及分組
　　1.1.體外

3、VSMCs實(shí)驗(yàn)
　　選擇4周齡健康雄性SD大鼠80g-100g（購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），運(yùn)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs。將VSMCs隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、高磷組、高鎂組和鎂通道抑制劑干預(yù)組（2-APB干預(yù)組）。(1)正常對(duì)照組：加入10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)；(2)高磷組：正常培基中加入10mMβ-甘油磷酸；(3)高鎂組：高磷培基中加入3mM硫酸鎂（MgSO4）；(4)2-APB干預(yù)組：高磷培基

4、中加入3mM硫酸鎂及10-4mM2-APB。
　　1.2.血管環(huán)實(shí)驗(yàn)
　　選擇1只6周齡健康雄性SD大鼠240-260 g（購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），無菌條件下取出胸主動(dòng)脈，將血管切成2mm-3 mm長的血管環(huán)。將血管環(huán)隨機(jī)分為4組（n=5）：正常對(duì)照組、高磷組、高鎂組、鎂通道抑制劑（2-APB）干預(yù)組。各組培養(yǎng)基同細(xì)胞培養(yǎng)。將剩余2只大鼠按照上述方法體外培養(yǎng)血管環(huán)，重復(fù)2次。
　　2.通過茜素紅鈣化染色檢測(cè)VS

5、MCs鈣化情況：結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：鈣鹽沉積處為橘紅色。細(xì)胞鈣含量測(cè)定：BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果用蛋白含量校準(zhǔn)鈣含量（mg/g蛋白）。細(xì)胞ALP活性由酶聯(lián)免疫吸附法來檢測(cè)，結(jié)果用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)。運(yùn)用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中BMP-2及Runx2的表達(dá)。
　　3.通過von Kossa鈣化染色檢測(cè)血管環(huán)鈣化情況，鈣鹽沉積處為棕黑色。鈣含量測(cè)定：鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測(cè)血管環(huán)鈣含量情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法

6、檢測(cè)血管環(huán)BMP-2及Runx2的表達(dá)。
　　4.數(shù)據(jù)分析符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.高鎂環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化和血管環(huán)鈣化的影響
　　1.1.高鎂環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的

7、血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響：細(xì)胞培養(yǎng)14天后，茜素紅染色及鈣含量結(jié)果均顯示，與正常對(duì)照組比較，高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯增多(P<0.05)；與高磷組比較，高鎂組細(xì)胞鈣鹽沉積減少(P<0.05)；與高鎂組相比，鎂通道抑制劑組細(xì)胞鈣鹽沉積增多(P<0.05)。
　　1.2.高鎂環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)鈣化的影響：血管環(huán)培養(yǎng)14天后，von Kossa染色結(jié)果顯示，高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)中

8、膜可見不同程度棕黑色鈣鹽沉積，但對(duì)照組、高鎂組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)均未發(fā)現(xiàn)棕黑色鈣鹽沉積；與高鎂組比較，高磷組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)中膜棕黑色鈣鹽沉積明顯增加。鈣含量測(cè)定結(jié)果基本與硝酸銀染色結(jié)果一致。
　　2.高鎂環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞BMP-2、Runx2表達(dá)及ALP活性表達(dá)的影響
　　RT-PCR及Western-blot結(jié)果顯示保持一致，與正常對(duì)照組相比，高磷組細(xì)胞BMP-2、Runx2表達(dá)明顯增加（P<0.05）；

9、與高磷組相比，高鎂組細(xì)胞BMP-2、Runx2表達(dá)明顯減少（P<0.05）；與高鎂組相比，鎂通道抑制劑干預(yù)組細(xì)胞BMP-2、Runx2表達(dá)增加（P<0.05）。ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示：高鎂環(huán)境抑制了ALP的活性（P<0.05）。
　　3.高鎂環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)BMP-2、Runx2表達(dá)的影響
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和高鎂組比較，高磷組和鎂通道抑制劑干預(yù)組大鼠BMP-2、Runx2表達(dá)增加(P<