高鎂通過調(diào)節(jié)BMP-2抑制高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的作用研究.pdf

1、目的：血管鈣化，多年來已被認為是終末期腎臟病患者的一個常見并發(fā)癥，它是導致終末期腎臟病患者心血管疾病（CVD）發(fā)生率及死亡率增加的重要原因。而最近的體外研究顯示[1]，鎂離子可以減輕血管鈣化，但潛在機制仍不明確。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)高鎂可在一定程度上抑制高磷誘導的血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化和成骨樣轉分化，其可能機制是通過降低VSMCs中骨源性相關因子的表達來實現(xiàn)，還有研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化過程與生理骨骼礦化有許多相似之處，是有組織

2、的主動調(diào)節(jié)過程，涉及許多促進和抑制鈣化因素。其中骨形成蛋白（BMPs）在促進血管鈣化形成中扮演著重要的角色。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenic protein-2，BMP-2)是目前研究最廣泛，也是公認的BMP家族中成骨活性最強的亞型[3]。因此，本研究以VSMCs鈣化為模型，研究高鎂對VSMCs成骨相關因子-骨形成蛋白2（BMP-2）表達的影響。
　　方法：
　　1.實驗方法及分組
　　1.1.體外

3、VSMCs實驗
　　選擇4周齡健康雄性SD大鼠80g-100g（購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心），運用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs。將VSMCs隨機分為4組，即正常對照組、高磷組、高鎂組和鎂通道抑制劑干預組（2-APB干預組）。(1)正常對照組：加入10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)；(2)高磷組：正常培基中加入10mMβ-甘油磷酸；(3)高鎂組：高磷培基中加入3mM硫酸鎂（MgSO4）；(4)2-APB干預組：高磷培基

4、中加入3mM硫酸鎂及10-4mM2-APB。
　　1.2.血管環(huán)實驗
　　選擇1只6周齡健康雄性SD大鼠240-260 g（購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心），無菌條件下取出胸主動脈，將血管切成2mm-3 mm長的血管環(huán)。將血管環(huán)隨機分為4組（n=5）：正常對照組、高磷組、高鎂組、鎂通道抑制劑（2-APB）干預組。各組培養(yǎng)基同細胞培養(yǎng)。將剩余2只大鼠按照上述方法體外培養(yǎng)血管環(huán)，重復2次。
　　2.通過茜素紅鈣化染色檢測VS

5、MCs鈣化情況：結果判斷標準：鈣鹽沉積處為橘紅色。細胞鈣含量測定：BCA法測定細胞蛋白含量，結果用蛋白含量校準鈣含量（mg/g蛋白）。細胞ALP活性由酶聯(lián)免疫吸附法來檢測，結果用蛋白質(zhì)校準。運用RT-PCR和Western-blot方法檢測各組細胞中BMP-2及Runx2的表達。
　　3.通過von Kossa鈣化染色檢測血管環(huán)鈣化情況，鈣鹽沉積處為棕黑色。鈣含量測定：鄰甲酚酞絡合酮比色法檢測血管環(huán)鈣含量情況。應用免疫組織化學方法

6、檢測血管環(huán)BMP-2及Runx2的表達。
　　4.數(shù)據(jù)分析符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（x s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用SNK檢驗（Student-Newman-Keuls）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.高鎂環(huán)境對高磷誘導的血管平滑肌細胞鈣化和血管環(huán)鈣化的影響
　　1.1.高鎂環(huán)境對高磷誘導的

7、血管平滑肌細胞鈣化的影響：細胞培養(yǎng)14天后，茜素紅染色及鈣含量結果均顯示，與正常對照組比較，高磷組及鎂通道抑制劑干預組細胞鈣鹽沉積明顯增多(P<0.05)；與高磷組比較，高鎂組細胞鈣鹽沉積減少(P<0.05)；與高鎂組相比，鎂通道抑制劑組細胞鈣鹽沉積增多(P<0.05)。
　　1.2.高鎂環(huán)境對高磷誘導的大鼠胸主動脈血管環(huán)鈣化的影響：血管環(huán)培養(yǎng)14天后，von Kossa染色結果顯示，高磷組及鎂通道抑制劑干預組大鼠胸主動脈血管環(huán)中

8、膜可見不同程度棕黑色鈣鹽沉積，但對照組、高鎂組大鼠胸主動脈血管環(huán)均未發(fā)現(xiàn)棕黑色鈣鹽沉積；與高鎂組比較，高磷組大鼠胸主動脈血管環(huán)中膜棕黑色鈣鹽沉積明顯增加。鈣含量測定結果基本與硝酸銀染色結果一致。
　　2.高鎂環(huán)境對高磷誘導的血管平滑肌細胞BMP-2、Runx2表達及ALP活性表達的影響
　　RT-PCR及Western-blot結果顯示保持一致，與正常對照組相比，高磷組細胞BMP-2、Runx2表達明顯增加（P<0.05）；

9、與高磷組相比，高鎂組細胞BMP-2、Runx2表達明顯減少（P<0.05）；與高鎂組相比，鎂通道抑制劑干預組細胞BMP-2、Runx2表達增加（P<0.05）。ALP活性測定結果顯示：高鎂環(huán)境抑制了ALP的活性（P<0.05）。
　　3.高鎂環(huán)境對高磷誘導的大鼠胸主動脈血管環(huán)BMP-2、Runx2表達的影響
　　免疫組織化學結果顯示，與正常對照組和高鎂組比較，高磷組和鎂通道抑制劑干預組大鼠BMP-2、Runx2表達增加(P<