高磷促血管平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究.pdf

1、心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)是慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)患者首發(fā)的死亡原因。終末期腎衰竭(end-stagerenaldisease，ESRD)透析患者的心血管死亡率是年齡匹配正常人群的20-40倍，心血管原因的死亡占透析患者總死亡原因的近50％。在CKD患者中，心血管疾病的發(fā)生可能與其并發(fā)的血管鈣化和動(dòng)脈硬化有關(guān)。高血磷是血管鈣化的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，降低血磷水平

2、可以減輕透析患者血管鈣化。高磷究竟如何促進(jìn)CKD患者血管鈣化，目前尚不十分清楚。我們用體外方法研究了高磷對(duì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響，并對(duì)其可能機(jī)制作了研究。研究分以下三部分。 第一部分：人血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng) 我們采用植塊貼壁法在體外成功培養(yǎng)了人臍動(dòng)脈來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)，人臍動(dòng)脈來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為典型的“峰、谷”樣生長(zhǎng)，這種生長(zhǎng)狀態(tài)，在傳代培養(yǎng)后保持不變

3、。在體外培養(yǎng)中，若血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)，則其細(xì)胞聚集生長(zhǎng)的區(qū)域，可以逐漸形成細(xì)胞結(jié)節(jié)。該結(jié)節(jié)中包含有大量的凋亡的血管平滑肌細(xì)胞，同時(shí)伴有大量鈣鹽沉積。免疫組化進(jìn)一步證實(shí)，該結(jié)節(jié)中彌漫分布著大量堿性磷酸酶。這些結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的人臍動(dòng)脈來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞同主動(dòng)脈來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞一樣，在體外培養(yǎng)中可以自發(fā)成骨分化并鈣化，是研究血管鈣化的一種好而實(shí)用的細(xì)胞材料。 第二部分：高磷培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影

4、響以及促其鈣化的機(jī)制研究 我們首先用MTT法、Hoechst33258染色法以及AnnexinV/PI雙染色法研究了高磷培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)，高磷具有微弱的促血管平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)，經(jīng)高磷培養(yǎng)24小時(shí)后，血管平滑肌細(xì)胞的增殖指數(shù)以及細(xì)胞存活數(shù)量均較正常磷濃度培養(yǎng)的對(duì)照組升高。但高磷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響更多地表現(xiàn)為促凋亡作用，在高磷培養(yǎng)24小時(shí)之后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡作用逐漸明顯。我們用熒光

5、定量PCR研究了高磷培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中Bax、caspase-3mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bax、caspase-3mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高，提示高磷培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)可能與之相關(guān)。我們的結(jié)果表明，高磷培養(yǎng)既可促血管平滑肌細(xì)胞增殖，又可促其發(fā)生凋亡，這兩種效應(yīng)可能共同參與了CKD患者血管病變的發(fā)病過(guò)程。 我們對(duì)高磷培養(yǎng)后的血管平滑肌細(xì)胞層中的鈣沉積作了定量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高磷培養(yǎng)可以顯著促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞

6、鈣化，且細(xì)胞層中的鈣含量隨著磷濃度、培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。我們又研究了非特異性caspase抑制劑ZVAD-FMK對(duì)高磷培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZVAD-FMK可以在一定程度上抑制高磷培養(yǎng)所致的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，提示高磷培養(yǎng)促血管平滑肌細(xì)胞鈣化與其促凋亡作用相關(guān)。 我們分別用熒光定量PCR和Westernblot從基因表達(dá)及蛋白表達(dá)水平對(duì)高磷培養(yǎng)后血管平滑肌細(xì)胞中骨相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，高磷培養(yǎng)后

7、血管平滑肌細(xì)胞中的骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白、骨形成蛋白-2表達(dá)升高，而Ⅳ型膠原表達(dá)相對(duì)減少，且EMSA研究表明高磷培養(yǎng)后血管平滑肌細(xì)胞中的骨特異性轉(zhuǎn)錄因子cbfal的活性增強(qiáng)。這些結(jié)果提示，高磷培養(yǎng)可促使血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生成骨細(xì)胞分化，這種機(jī)制主要參與了高磷培養(yǎng)促血管平滑肌細(xì)胞鈣化的過(guò)程。 另外，我們也研究了高磷培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中鈣化抑制因子骨橋蛋白、骨保護(hù)素、基質(zhì)Gla蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白、骨保護(hù)素的蛋白表

8、達(dá)水平升高，但基因的表達(dá)水平卻有降低趨勢(shì)，而基質(zhì)Gla蛋白的基因表達(dá)則是先升高后降低。我們推測(cè)這種差異可能是負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。這些抑制鈣化因子的平衡調(diào)節(jié)紊亂機(jī)制可能也共同參與了高磷培養(yǎng)所致的血管平滑肌細(xì)胞鈣化過(guò)程。 第三部分：無(wú)血清培養(yǎng)促血管平滑肌細(xì)胞凋亡和成骨分化的研究 我們研究了無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡和成骨分化的影響，結(jié)果表明，無(wú)血清培養(yǎng)在致血管平滑肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，可促其發(fā)生成骨分化并鈣化。結(jié)果提示血管平滑肌