胞外PH值及其波動(dòng)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的:
　　目前，有關(guān)PH值及其波動(dòng)對(duì)慢性腎臟病患者血管鈣化的研究較少見(jiàn)。因此，本課題擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究PH值及其波動(dòng)對(duì)CKD血管鈣化的影響，探討其在CKD血管鈣化進(jìn)展中的作用機(jī)制以及干預(yù)Gas6/AXL-PI3K/AKT信號(hào)通路能否作為CKD血管鈣化的治療靶點(diǎn)。研究結(jié)果有望進(jìn)一步闡明CKD血管鈣化的發(fā)病機(jī)制以及尋找CKD及ESRD患者治療的新靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)具有潛在治療作用的靶向藥物提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1

2、.終末期腎臟病患者冠脈鈣化影響因素的研究
　　選取2014年至2015年在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液凈化中心行規(guī)律血液透析(3次/周)ESRD患者53例，根據(jù)冠脈鈣化評(píng)分(coronary arterycalcification score，CACs)分為鈣化陰性組、鈣化陽(yáng)性組（輕度鈣化組、中度鈣化組、重度鈣化組）。收集臨床一般資料，采集一周首次透析前動(dòng)脈血測(cè)定血常規(guī)、肝功能、電解質(zhì)、血脂、C反應(yīng)蛋白(CRP)、β2-微球蛋白（β2

3、-MG）、游離甲狀旁腺素(iPTH)、纖維蛋白原、鐵蛋白等;并同次測(cè)定透析前、透析后動(dòng)脈血PH值，計(jì)算△PH（PH透后-PH透前）。通過(guò)冠脈鈣化評(píng)分與一般資料、上述血生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性、Logistic回歸等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討ESRD患者冠脈鈣化的發(fā)生情況及其影響因素。
　　2.PH及其波動(dòng)對(duì)慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈血管鈣化的影響及機(jī)制研究
　　通過(guò)5/6腎切除術(shù)來(lái)構(gòu)建大鼠慢性腎衰竭的模型，飼喂骨化三醇引起大鼠血管鈣化的發(fā)生，腹腔

4、注射分別注射NH4Cl、NaHCO3和隔天交替注射NH4Cl、NaHCO3構(gòu)建大鼠慢性代謝性酸中毒、慢性代謝性堿中毒和酸堿波動(dòng)的模型。將34只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)組(n=6)、慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)、酸干預(yù)組(n=6)、堿干預(yù)組(n=6)和酸堿波動(dòng)組(n=6)。30天之后，于大鼠的腹主動(dòng)脈穿刺采血，血?dú)夥治鰷y(cè)定動(dòng)脈血pH，動(dòng)脈血用肝素抗凝，離心后，分離血漿，-80℃凍存?zhèn)溆?。取大鼠?/p>

5、腹主動(dòng)脈全長(zhǎng)，用于組織學(xué)觀察和鈣含量測(cè)定。
　　3.胞外PH及其波動(dòng)對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及鈣化的影響
　　選取8～10周齡健康雄性SD大鼠6只，分別體外分離培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定。將VSMCs隨機(jī)分為PH7.4組、PH7.4+磷組、PH6.8+磷組、PH7.7+磷組、PH6.8/7.7+磷組，刺激10天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鈣含量檢測(cè);茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié);刺激6天后進(jìn)行堿性

6、磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runx2) mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.終末期腎臟病患者冠脈鈣化影響因素的研究
　?、偃虢MESRD患者53例，按照其冠狀動(dòng)脈鈣化的程度分成四組，其中年齡越大、透齡越長(zhǎng)、血磷越高，鈣化程度越強(qiáng)，而舒張壓、白蛋白、△PH越小，鈣化程度越重。與陰性組比較，上述指標(biāo)重度鈣化組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其中透齡中度鈣化組

7、與陰性組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。②ESRD患者冠狀動(dòng)脈鈣化積分與年齡（r=0.269，P＜0.05）、透齡(r=0.341，＜0.01)、血鈣水平(r=0.358，P＜0.01)、血磷水平(r=0.186，P＜0.05)及PH透前(r=0.275，P＜0.05)呈正相關(guān)，與白蛋白(r=-0.192，P＜0.05)、△PH(r=-0.302，P＜0.05)呈負(fù)相關(guān);對(duì)其鈣化評(píng)分取對(duì)數(shù)值后，仍有如上的相關(guān)關(guān)系。③Logistic

8、回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):年齡、△PH、透齡和血磷水平是患者發(fā)生冠脈鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　2.酸、堿性環(huán)境及其波動(dòng)對(duì)慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈血管鈣化的影響及機(jī)制研究
　?、偎嵝原h(huán)境對(duì)慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈鈣化的影響:與假手術(shù)組(n=6)大鼠相比，慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)及酸干預(yù)組(n=6)大鼠血肌酐和尿素氮水平均顯著增高(P＜0.05);與假手術(shù)組、慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=6)分別比較，酸干預(yù)組大鼠動(dòng)脈血p

9、H和[HCO3-]水平均下降(P＜0.05)。von Kossa染色結(jié)果顯示:鈣化組大鼠主動(dòng)脈發(fā)生明顯鈣化，但假手術(shù)組、慢性腎衰竭組和酸干預(yù)大鼠主動(dòng)脈均未發(fā)生主動(dòng)脈鈣化。鈣含量結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，慢性腎衰竭組大鼠主動(dòng)脈鈣含量無(wú)明顯增高（2.46±1.23vs2.44±0.56，P＞0.05）;鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣含量較假手術(shù)組和慢性腎衰竭組大鼠均顯著增高（9.73±1.83vs2.44±0.56，9.73±1.83vs2.46±1

10、.23，P＜0.05）;與鈣化組相比，酸干預(yù)大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯降低（9.73±1.83vs5.27±2.12，P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，慢性腎衰竭組大鼠主動(dòng)脈Runx2、Caspase3免疫組化評(píng)分無(wú)明顯差異（2.95±1.10vs2.25±0.82;2.72±0.86vs1.46±1.22，P＞0.05）;鈣化組大鼠主動(dòng)脈Runx2、Caspase3免疫組化評(píng)分較假手術(shù)組和慢性腎衰竭組大鼠均顯著增高（6.1

11、6±1.59vs2.25±0.82，6.16±1.59vs2.95±1.10;6.62±1.31vs1.46±1.22，6.62±1.31 vs2.72±0.86，P＜0.05）;與鈣化組相比，酸干預(yù)大鼠主動(dòng)脈Runx2、Caspase3免疫組化評(píng)分顯著降低（6.16±1.59vs4.11±0.92;6.62±1.31vs3.60±1.43，P＜0.05）。②堿性環(huán)境對(duì)慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈鈣化的影響:與假手術(shù)組、慢性腎衰竭組、鈣化組分別

12、比較，堿干預(yù)組大鼠動(dòng)脈血PH水平升高（P＜0.05），假手術(shù)組、慢性腎衰組、鈣化組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組大鼠相比，慢性腎衰竭組、鈣化組及堿干預(yù)組大鼠血漿肌酐和尿素氮水平均顯著增高(P＜0.05)。Von Kossa染色結(jié)果顯示:與假手術(shù)組、慢性腎衰竭組相比，鈣化組、堿干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈鈣化明顯。鈣含量結(jié)果顯示，堿干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈鈣含量較假手術(shù)組和慢性腎衰竭組大鼠均顯著增高(13.86±3.16vs2.44±0.56，13.86±

13、3.16vs2.46±1.23，P＜0.05);與鈣化組相比，堿干預(yù)大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯升高（13.86±3.16vs9.73±1.83，P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，堿干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈Runx2、Caspase3免疫組化評(píng)分較假手術(shù)組和慢性腎衰竭組大鼠均顯著增高（8.96±1.36vs2.25±0.82，8.96±1.36vs2.95±1.10;8.01±0.74vs1.46±1.22，8.01±0.74vs2.72±0.86，P

14、＜0.05）;與鈣化組相比，堿干預(yù)大鼠主動(dòng)脈Runx2、Caspase3免疫組化評(píng)分顯著升高（8.96±1.36vs6.16±1.59;8.01±0.74vs6.62±1.31，P＜0.05）。
　　3.胞外PH及其波動(dòng)對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及鈣化的影響
　?、俨煌琍H值胞外刺激10天后5組大鼠VSMCs鈣含量比較，PH6.8+磷組低于PH7.7+磷組(P＜0.05)和PH6.8/7.7+磷組(P＜0.05)

15、; PH6.8/7.7+磷組低于PH7.7+磷組（P＜0.05）。茜素紅染色結(jié)果與鈣含量測(cè)定結(jié)果一致。②不同PH值胞外刺激6天后5組大鼠VSMCs ALP活性比較，PH6.8+磷組低于PH7.7+磷(P＜0.05)和PH6.8/7.7+磷組(P＜0.05); PH6.8/7.7+磷組低于PH7.7+磷組(P＜0.05)。③不同PH值胞外刺激6天后5組大鼠VSMCs Runx2 mRNA表達(dá)量比較，PH6.8+磷組低于PH7.7+磷(P＜

16、0.05)和PH6.8/7.7+磷組(P＜0.05); PH6.8/7.7+磷組低于PH7.7+磷組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.ESRD患者冠脈鈣化受多種因素的影響，年齡、透齡、血磷、△PH是患者發(fā)生冠脈鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而透前PH在△PH對(duì)冠脈鈣化的影響中起著重要作用。
　　2.酸性環(huán)境能夠抑制慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈鈣化，而堿性環(huán)境及酸堿波動(dòng)能夠促進(jìn)慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈鈣化。其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Runx2

17、和Caspase3表達(dá)進(jìn)而干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)血管鈣化的影響。
　　3.胞外酸性環(huán)境能夠抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，而胞外堿性環(huán)境及酸堿波動(dòng)促進(jìn)其鈣化，其機(jī)制可能是通過(guò)升高或降低了Runx2及ALP的表達(dá)而促進(jìn)或抑制了VSMCs成骨成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)的。
　　4.胞外酸性環(huán)境能夠抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs凋亡，而胞外堿性環(huán)境及酸堿波動(dòng)促進(jìn)其凋亡。其機(jī)制可能是通過(guò)影響了Bcl-2、Bax及Casp