Angptl2對(duì)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響.pdf

1、目的:
　　炎癥因子可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展及動(dòng)脈粥樣硬化鈣化的生成，而平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化鈣化中起到很關(guān)鍵的作用，血管生成素樣蛋白2(ANGPTL2)作為一種炎癥因子具有很強(qiáng)的致動(dòng)脈粥樣硬化作用，其是否對(duì)血管鈣化產(chǎn)生影響尚未有研究報(bào)道，本研究旨在觀察血管生成素樣蛋白2對(duì)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)鈣化的影響。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)采用A7r5細(xì)胞株作為鈣化模型制作細(xì)胞，用含10mmol/Lβ甘油磷酸鹽(

2、β-GP)培養(yǎng)液培育9d建立體外細(xì)胞鈣化模型，馮庫(kù)薩染色法鑒定細(xì)胞鈣化;首先用重組ANGPTL2濃度梯度干預(yù)后，Western blot方法檢測(cè)Runx2蛋白表達(dá)水平，馮庫(kù)薩染色法鑒定各組細(xì)胞的鈣化程度，鈣離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞鈣離子含量并測(cè)量蛋白標(biāo)化，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞間堿性磷酸酶活性并測(cè)量蛋白標(biāo)化。重組ANGPTL2時(shí)間梯干預(yù)后，Western blot方法檢測(cè)Runx2蛋白表達(dá)水平，鈣離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞鈣

3、離子含量并測(cè)量蛋白標(biāo)化，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞間堿性磷酸酶活性并測(cè)量蛋白標(biāo)化。最后重組ANGPTL2干預(yù)及抗ANGPTL2中和抗體阻斷其生物學(xué)活性，每次首先加入重組ANGPTL2孵育30min后，用PBS清洗兩邊后加入抗ANGPTL2中和抗體，每3d換液一次，孵育9d后，共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞間鈣化程度的形念學(xué)差異，鈣離子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞鈣離子含量并測(cè)量蛋白標(biāo)化，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞間堿性磷酸酶活性并測(cè)量蛋

4、白標(biāo)化。CCK8檢測(cè)ANGPTL2對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)β甘油磷酸鹽(β-GP)誘導(dǎo)9d后成功建立血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型。
　　(2) ANPTL2對(duì)細(xì)胞鈣化的影響呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，在10ng/ml濃度細(xì)胞鈣化及鈣離子沉積量、堿性磷酸酶活性、Runx2蛋白的表達(dá)量達(dá)到最強(qiáng)生物學(xué)效應(yīng)，ANGPTL2干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞后，Runx2蛋白表達(dá)顯著增高，并且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性，蛋白表達(dá)在第9d

5、增加最為明顯，同樣的細(xì)胞鈣堿性磷酸酶活性也在第9d達(dá)到峰。
　　(3)馮庫(kù)薩染色結(jié)果顯示經(jīng)ANGPTL2干預(yù)9d后血管平滑肌細(xì)胞鈣化程度較同型對(duì)照組顯著增加，而阻斷ANGPTL2生物學(xué)活性后細(xì)胞鈣化程度較干預(yù)組顯著降低，ANGPTL2可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣離子的沉積量增加，堿性磷酸酶的活性及鈣化生物學(xué)標(biāo)記物Runx2的蛋白表達(dá)量均較同型對(duì)照組顯著增加，經(jīng)抗ANGPTL2中和抗體阻斷后細(xì)胞鈣離子沉積量、堿性磷酸酶活性、Runx2蛋白