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文檔簡介
1、目的:
我們由上述背景資料推測:WISP1可能通過與Akt信號通路調節(jié)VSMC的增殖和遷移,從而參與血管再狹窄的發(fā)生。本研究擬通過WISP1對于人胸主動脈血管平滑肌細胞(HAVSMC)增殖和遷移的作用及相關信號通路的研究,以試圖進一步探尋WISP1對血管平滑肌細胞增殖和遷移的調控機制,為尋求新的血管再狹窄治療藥物提供科學依據和理論基礎,并為藥物球囊的設計提供新的藥物靶點。
簡言之,本研究的目的為(1)檢測血管平滑肌細
2、胞增殖過程中WISP1的表達關系;(2)檢測WISP1蛋白與血管平滑肌細胞增殖和遷移關系;(3)探索WISP1蛋白調控血管平滑肌細胞增殖和遷移信號通路。
方法:
(1)觀察在不同濃度血清引起HAVSMC增殖狀態(tài)下細胞WISP1蛋白表達水平的影響:在細胞體外培養(yǎng)條件下,使用不同濃度血清(0%FBS、2%FBS、10%FBS)培養(yǎng)胸主動脈血管平滑機細胞(HAVSMC)48小時后,使用EdU細胞增殖檢測法檢測組別間HAVS
3、MC的增殖狀態(tài),同時利用Western blot技術檢測WISP1的表達量,統計各組間差異。
(2)構建WISP1在HAVSMC中的過表達及缺失模型并驗證:使用腺病毒轉染技術,分別轉染含WISP1基因的腺病毒及空載體病毒(MOI=10),轉染后24小時、48小時在熒光顯微鏡下拍照,48小時后利用Western blot技術檢測轉染病毒后兩組細胞中WISP1蛋白的表達水平。
(3) EdU細胞增殖檢測方法檢測過表達WI
4、SP1對細胞增殖變化影響:轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24小時,使用EdU細胞增殖檢測方法檢測轉染病毒后兩組細胞增殖水平,統計各組間EdU標記陽性細胞個數比值差異。
(4)細胞劃痕實驗方法檢測WISP1對細胞遷移的影響:轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24小時,選取5個不同時間點(0小時、6小時、12小時、24小時、48小時)在顯微鏡下觀察并記錄轉染病毒后兩組細胞遷移的情況,統計兩組間細胞遷移速度差異。
5、r> (5) Transwell細胞遷移實驗方法檢測WISP1對細胞遷移的影響:轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24h,收集細胞接種至Transwell小室上室(細胞數約為5×104個細胞),遷移24小時后固定、染色,顯微鏡下拍照,統計兩組間遷移細胞個數差異。
(6)觀察WISP1誘導HAVSMC增殖及遷移的信號通路激活情況:轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24小時,利用Western blot技術檢測Akt
6、,p-Akt的表達量,統計分析p-Akt/Akt比值差異。
(7)驗證Akt信號在WISP1誘導HAVSMC增殖及遷移中的作用:轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24小時,使用或不使用Akt抑制劑AZD5363(濃度=5μM)處理轉染后的細胞,分別使用上述檢測增殖和遷移的方法,觀察過表達WISP1后抑制劑對HAVSMC增殖及遷移作用的影響,并使用Western blot技術檢測Akt下游分子p-GSK3/GSK3、MMP
7、9、cyclinD1蛋白的表達情況。
結果:
(1)轉染后24小時、48小時在熒光顯微鏡下觀察到轉染病毒后兩組細胞均表達綠色熒光,Western blot結果示,轉染含WISP1腺病毒的細胞(過表達WISP1組)中WISP1蛋白的表達水平顯著高于轉染空載體病毒細胞組(空載體細胞組)(P<0.05)。
(2)經體外貼壁培養(yǎng)細胞48小時后,血管平滑肌細胞的EdU標記陽性細胞個數比值與血清濃度呈劑量依賴方式增加,
8、對比無血清培養(yǎng)的血管平滑肌細胞,EdU標記陽性細胞數比值分別增加2.5倍(2%FBS)和3.0倍(10%FBS)(P<0.05)。低血清組細胞和高血清組細胞的WISP1表達水平明顯高于無血清培養(yǎng)細胞,WISP1蛋白表達量分別增加3.4倍(2%FBS)和4.1倍(10%FBS),差異有統計學意義(P<0.05)。
(3) EdU細胞增殖檢測結果顯示:轉染后24小時,與空載體組細胞相比,過表達WISP1組的血管平滑肌細胞EdU標記
9、陽性細胞個數比值升高2.98倍,差異有統計學意義(P<0.05)。
(4)細胞劃痕實驗結果顯示:轉染后24小時,與空載體組細胞相比,過表達WISP1組的血管平滑肌細胞增殖細胞在6小時開始明顯快于空載體組細胞(4.56±1.14% vs.11.23±2.25%,p<0.05),并在48小時兩組間差異達到最大(25.25±5.51% vs.97.54±13.12%,p<0.01);過表達組細胞在48小時細胞接近于融合。
10、(5) Transwell細胞遷移實驗結果顯示:轉染后24小時,與空載體組細胞相比,過表達WISP1組的血管平滑肌細胞的遷移數量顯著多于空載體組細胞,上升2.25倍,差異具有統計學意義(P<0.05)。
(6) Western blot檢測結果顯示:轉染后24小時,與空載體組細胞相比,過表達WISP1組的血管平滑肌細胞增殖細胞中,轉染后的p-Akt表達量明顯增加,而總的Akt表達量未明顯變化,經統計p-Akt/Akt比值升高3
11、.2倍,差異具有統計學意義(P<0.05)。
(7)轉染WISP1過表達腺病毒及空載體病毒后24小時,使用或不使用Akt抑制劑AZD5363(濃度=5μM)處理轉染后的細胞(共4組細胞)。其中,與單純過表達組細胞相比,過表達WISP1組的細胞經AZD5363處理后,EdU標記陽性細胞數比值下調(P<0.05);劃痕實驗顯示:細胞遷移速度在12小時至48小時明顯減慢(P<0.05);Transwell細胞遷移實驗結果顯示:遷移2
12、4小時細胞數明顯減少(P<0.05)。Western blot檢測結果顯示Akt下游分子:GSK3、MMP9、cyclinD1的蛋白表達也受到抑制,與單純過表達組細胞相比,過表達WISP1組的血管平滑肌細胞中檢測到p-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD1蛋白的表達量都呈下降趨勢(P<0.05)。
結論:
(1)在不同濃度血清(0%FBS、2%FBS、10%FBS)刺激下的血管平滑肌細胞(HAVSMC)增殖水
13、平呈增高趨勢,促進增殖的過程中內源性WISP1表達與細胞增殖水平存在正相關關系。
(2)過表達WISP1能夠促進血管平滑肌的增殖及遷移。
(3) WISP1促進血管平滑肌的增殖及遷移過程中伴隨Akt信號通路激活。
(4)阻斷Akt信號可抑制WISP1調控血管平滑肌的增殖、遷移,同時下調Akt下游分子p-GSK3/GSK3、MMP9、cyclinD1的表達水平??傊?,WISP1促進血管平滑肌的增殖及遷移與Ak
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