小檗堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響.pdf

1、目的：經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)以及支架術(shù)是治療冠心病的重要而有效的方法，已經(jīng)成功應(yīng)用多年，但支架植入術(shù)術(shù)后再狹窄(restenosis,RS)限制了它的發(fā)展。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)及支架術(shù)術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。藥物洗脫支架(drug elutingstent,DES)的應(yīng)用已使血管損傷后再狹窄率顯著降低，隨著治療藥

2、物緩慢釋放入血管壁，血管損傷后血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移受到抑制，從而減少了血管重塑和支架植入后再狹窄。近年臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)藥物洗脫支架植入后再狹窄率為5-10％，而傳統(tǒng)裸支架植入后再狹窄率為20-25％<'[1，2]。本研究觀察小檗堿對(duì)體外血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。 方法：用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，傳到8～10代，根據(jù)小檗堿作用時(shí)間不同分成24小時(shí)組和72小時(shí)組，每一時(shí)間組根據(jù)加入小

3、檗堿的濃度不同分為5組：0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L組。不同濃度小檗堿作用24小時(shí)、72小時(shí)后分別用臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)溶液染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用四甲基偶氮唑藍(lán)法(methylthiazoletrazolium,MTT)于酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，以觀察藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。不同濃度小檗堿作用后，用Boyden小室法檢測(cè)穿過(guò)硝酸纖維素濾膜

4、(cellulose nitrate membranes，CN)的細(xì)胞數(shù)，以觀察小檗堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記方法(TUNEL)計(jì)算各濃度小檗堿作用后細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以觀測(cè)小檗堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示小檗堿作用24小時(shí)后，對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小

5、檗堿干預(yù)組活細(xì)胞數(shù)分別為3.51±0.54×10<'8>/L、2.65±0.03×10<'8>/L、2.17±0.04×10<'8>/L、1.76±0.01×10<'8>/L和1.68±0.05×10<'8>/L，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨小檗堿濃度增加，活細(xì)胞數(shù)減少。小檗堿作用72小時(shí)對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小檗堿干預(yù)組活細(xì)胞數(shù)分別為5.39±0.

6、94×10<'8>/L、3.64±0.03×10<'8>/L、2.40±0.06×10<'8>/L、2.16±0.04×10<'8>/L和2.01±0.07×10<'8>/L，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨小檗堿濃度增加，活細(xì)胞數(shù)減少。MTT法檢測(cè)顯示小檗堿作用24小時(shí)后，對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小檗堿干預(yù)組A值分別為0.139±0.024、0.061±

7、0.014、0.058±0.005、0.057±0.005和0.056±0.005，小檗堿作用72小時(shí)后，對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小檗堿干預(yù)組A值分別為0.196±0.118、0.060±0.013、0.057±0.007、0.054±0.002和0.054±0.005，24小時(shí)、72小時(shí)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，隨小檗堿濃度增加，MTFA值增加。

8、 Boyden小室法檢測(cè)顯示小檗堿作用48小時(shí)后，對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小檗堿干預(yù)組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為.50.61±12.11個(gè)/高倍視野、31.23±2.61個(gè)/高倍視野、24.50±1.67個(gè)/高倍視野、20.39±2.25個(gè)/高倍視野和19.52±1.64個(gè)/高倍視野。各濃度小檗堿組對(duì)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移均有抑制作用(P<0.05)，隨小檗堿濃度增加，穿膜細(xì)胞

9、數(shù)減少。TUNEL檢測(cè)顯示各組施加干預(yù)后48小時(shí)對(duì)照組、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L濃度小檗堿干預(yù)組的凋亡陽(yáng)性率分別為13.15±1.83％、12.04±1.36％、10.62±1.21％、9.73±1.68％和9.72±1.16％，各濃度小檗堿組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異性(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)小檗堿作用血管平滑肌細(xì)胞48小時(shí)后，對(duì)照組、50μmol/L和100μmol/L濃度小檗堿

10、干預(yù)組細(xì)胞凋亡率分別為20.4％、18.7％和17.2％。 結(jié)論：與對(duì)照組相比，各濃度小檗堿組均使血管平滑肌細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)減少，MTTA值增加，生長(zhǎng)抑制率增高，隨著小檗堿干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)減少，MTTA值增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加。與對(duì)照組相比，各濃度小檗堿組均使血管平滑肌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)減少，隨小檗堿濃度增加，穿膜細(xì)胞數(shù)減少。與對(duì)照組相比，各濃度小檗堿組未使細(xì)胞凋亡率增加。小檗堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移有顯著抑制作用，而小