丹皮酚對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡部分機(jī)制的研究.pdf

1、心血管疾病是世界上嚴(yán)重危害人民生命和健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居各種疾病前列，動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）增殖形成As病變是As發(fā)生、發(fā)展的重要步驟，As也可能是一種VSMCs的良性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展取決于細(xì)胞增生和凋亡這對(duì)矛盾相互作用的結(jié)果，因此有效地控制VSMCs增殖已成

2、為治療As的一種手段。丹皮酚（paeonal， Pae）是毛茛科植物牡丹Paeorcia Suffruficoas Andr的干燥根皮及蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿Cynanchum paniculatium(Bunge) Krtag 的主要活性成分，我們已有大量研究證實(shí)Pae對(duì)As模型的形成和發(fā)展過(guò)程有一定干預(yù)作用。本研究在培養(yǎng)家兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀(guān)察Pae體內(nèi)和外給藥抑制VSMCs增殖、誘導(dǎo)凋亡及對(duì)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響，從分子機(jī)制及

3、As發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)來(lái)探索Pae對(duì)As的作用及作用特點(diǎn)。 目的:探索高效快速的家兔血管平滑肌細(xì)胞體外原代培養(yǎng)及傳代技術(shù)，為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供足量可靠的細(xì)胞來(lái)源；體外和體內(nèi)給藥觀(guān)察Pae對(duì)家兔VSMCs增殖的抑制作用及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制；觀(guān)察Pae對(duì)體外培養(yǎng)的家兔VSMCs凋亡的誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制。 方法：采用組織塊預(yù)消化法對(duì)家兔血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性，免疫組化法鑒

4、定血管平滑肌細(xì)胞。家兔灌胃Pae150mg/kg制備含藥血清，MTT法測(cè)定Pae對(duì)VSMCs增殖的抑制作用，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布特征。相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀(guān)察Pae對(duì)VSMCs形態(tài)學(xué)的改變，流式細(xì)胞儀分析VSMCs凋亡率，免疫組化檢測(cè)VSMCs p53、C-myc蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 1．組織塊預(yù)消化法培養(yǎng)家兔血管平滑肌原代細(xì)胞 組織塊經(jīng)0.15％膠原酶液消化6h后貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，速度較快，純

5、度相對(duì)較高，原代培養(yǎng)時(shí)間為7d～10d。 2．Pae體外給藥對(duì)VSMCs增殖的抑制作用 以Pae100、150及200mg/L三種濃度分別作用于VSMCs 24h、48h、72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上三種濃度在24h時(shí)即可對(duì)VSMCs的增殖呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，且在72h內(nèi)對(duì)VSMCs的增殖持續(xù)保持明顯的抑制作用。 3.Pae含藥血清對(duì)VSMCs增殖的抑制作用 以15％、20％、25％三個(gè)濃度的含藥血清分別作用

6、于VSMCs24h、48h、72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上三種濃度在24h時(shí)即可對(duì)VSMCs的增殖呈現(xiàn)出明顯的抑制作用， 25％含藥血清作用于VSMCs 24h、48h、72h的抑制率分別為36.3％、66.5％、80.1％，抑制效應(yīng)呈時(shí)間依賴(lài)性； 20％含藥血清在72h內(nèi)對(duì)VSMCs的增殖持續(xù)保持明顯的抑制作用； 15％含藥血清在72h內(nèi)隨著時(shí)間的增加其抑制作用逐漸減弱。 4.Pae體外給藥對(duì)VSMCs周期的調(diào)控作用 Pae3

7、1.25、62.5及125mg/L三種濃度組S期和G2/M期的細(xì)胞所占比例顯著小于對(duì)照組；對(duì)照組中G0/G1期的細(xì)胞所占比例減少，Pae31.25、62.5及125mg/L三種濃度組G0/G1期的細(xì)胞所占比例顯著高于對(duì)照組。 5．Pae體外給藥對(duì)VSMCs形態(tài)學(xué)改變 相差顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，VSMCs傳至4～6代代融合時(shí)，胞體細(xì)長(zhǎng)，呈長(zhǎng)的梭形，多層生長(zhǎng)，具有典型的“峰”，“谷”現(xiàn)象。加含Pae 31.25mg/L的10％胎

8、牛血清的DMEM培養(yǎng)液后，VSMCs與對(duì)照組相比，發(fā)生不同程度的收縮，細(xì)胞連接疏松，細(xì)胞間間隙擴(kuò)大，細(xì)胞體積變小，胞漿皺縮呈多角形，或星芒狀，個(gè)別胞核皺縮，或模糊不清?！胺濉保肮取爆F(xiàn)象尚存。而Pae 62.5、125 mg/L實(shí)驗(yàn)組，VSMCs明顯收縮，大多數(shù)細(xì)胞漿皺縮，細(xì)胞間連接疏松，甚至細(xì)胞變圓附于其它細(xì)胞上，在谷的位置VSMCs稀疏，部分脫落；而“峰”處細(xì)胞較多，收縮呈簇。熒光顯微鏡下觀(guān)察，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)早期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核為

9、AO 染色呈黃綠色熒光，濃聚成新月形或顆粒狀，位于細(xì)胞的一側(cè)。 6．Pae體外給藥對(duì)VSMCs凋亡率的影響 Pae作用VSMCs 36h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，Pae 31.25、62.5和120mg/L濃度組的DNA直方圖可見(jiàn)到較明顯的亞二倍體峰（Sub－G1峰），其凋亡率分別為(5.83±0.21)％、(7.14±0.71)％和(6.72±0.39)％；空白對(duì)照組的凋亡率為(2.06±0.23)％。Pae31.

10、25、62.5及120mg/L三種濃度組與空白對(duì)照組比較凋亡率明顯增加。 7.Pae體外給藥對(duì)VSMCs p53、C-myc蛋白表達(dá)的影響 Pae 62.5和120mg/L濃度組可使VSMCs的p53蛋白表達(dá)顯著增加，而C-myc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論： 家兔主動(dòng)脈組織塊經(jīng)0.15％膠原酶液消化6h后貼壁培養(yǎng)的方法可為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供足量可靠的細(xì)胞來(lái)源。Pae一定濃度體內(nèi)、外給藥均可抑制VSMC