丹皮酚對血管平滑肌細胞增殖和凋亡部分機制的研究.pdf

1、心血管疾病是世界上嚴重危害人民生命和健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居各種疾病前列，動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）是心血管疾病的主要病理基礎。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）增殖形成As病變是As發(fā)生、發(fā)展的重要步驟，As也可能是一種VSMCs的良性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展取決于細胞增生和凋亡這對矛盾相互作用的結果，因此有效地控制VSMCs增殖已成

2、為治療As的一種手段。丹皮酚（paeonal， Pae）是毛茛科植物牡丹Paeorcia Suffruficoas Andr的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatium(Bunge) Krtag 的主要活性成分，我們已有大量研究證實Pae對As模型的形成和發(fā)展過程有一定干預作用。本研究在培養(yǎng)家兔主動脈平滑肌細胞的基礎上，觀察Pae體內(nèi)和外給藥抑制VSMCs增殖、誘導凋亡及對相關基因表達調控的影響，從分子機制及

3、As發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)來探索Pae對As的作用及作用特點。 目的:探索高效快速的家兔血管平滑肌細胞體外原代培養(yǎng)及傳代技術，為分子生物學實驗提供足量可靠的細胞來源；體外和體內(nèi)給藥觀察Pae對家兔VSMCs增殖的抑制作用及細胞周期調控機制；觀察Pae對體外培養(yǎng)的家兔VSMCs凋亡的誘導作用及其分子機制。 方法：采用組織塊預消化法對家兔血管平滑肌細胞進行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，臺盼藍染色檢測細胞活性，免疫組化法鑒

4、定血管平滑肌細胞。家兔灌胃Pae150mg/kg制備含藥血清，MTT法測定Pae對VSMCs增殖的抑制作用，流式細胞儀分析細胞周期分布特征。相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察Pae對VSMCs形態(tài)學的改變，流式細胞儀分析VSMCs凋亡率，免疫組化檢測VSMCs p53、C-myc蛋白表達。 結果: 1．組織塊預消化法培養(yǎng)家兔血管平滑肌原代細胞 組織塊經(jīng)0.15％膠原酶液消化6h后貼壁培養(yǎng)，細胞生長密度高，速度較快，純

5、度相對較高，原代培養(yǎng)時間為7d～10d。 2．Pae體外給藥對VSMCs增殖的抑制作用 以Pae100、150及200mg/L三種濃度分別作用于VSMCs 24h、48h、72h，結果發(fā)現(xiàn)以上三種濃度在24h時即可對VSMCs的增殖呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，且在72h內(nèi)對VSMCs的增殖持續(xù)保持明顯的抑制作用。 3.Pae含藥血清對VSMCs增殖的抑制作用 以15％、20％、25％三個濃度的含藥血清分別作用

6、于VSMCs24h、48h、72h，結果發(fā)現(xiàn)以上三種濃度在24h時即可對VSMCs的增殖呈現(xiàn)出明顯的抑制作用， 25％含藥血清作用于VSMCs 24h、48h、72h的抑制率分別為36.3％、66.5％、80.1％，抑制效應呈時間依賴性； 20％含藥血清在72h內(nèi)對VSMCs的增殖持續(xù)保持明顯的抑制作用； 15％含藥血清在72h內(nèi)隨著時間的增加其抑制作用逐漸減弱。 4.Pae體外給藥對VSMCs周期的調控作用 Pae3

7、1.25、62.5及125mg/L三種濃度組S期和G2/M期的細胞所占比例顯著小于對照組；對照組中G0/G1期的細胞所占比例減少，Pae31.25、62.5及125mg/L三種濃度組G0/G1期的細胞所占比例顯著高于對照組。 5．Pae體外給藥對VSMCs形態(tài)學改變 相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，VSMCs傳至4～6代代融合時，胞體細長，呈長的梭形，多層生長，具有典型的“峰”，“谷”現(xiàn)象。加含Pae 31.25mg/L的10％胎

8、牛血清的DMEM培養(yǎng)液后，VSMCs與對照組相比，發(fā)生不同程度的收縮，細胞連接疏松，細胞間間隙擴大，細胞體積變小，胞漿皺縮呈多角形，或星芒狀，個別胞核皺縮，或模糊不清。“峰”，“谷”現(xiàn)象尚存。而Pae 62.5、125 mg/L實驗組，VSMCs明顯收縮，大多數(shù)細胞漿皺縮，細胞間連接疏松，甚至細胞變圓附于其它細胞上，在谷的位置VSMCs稀疏，部分脫落；而“峰”處細胞較多，收縮呈簇。熒光顯微鏡下觀察，實驗組可見早期凋亡細胞，表現(xiàn)為細胞核為

9、AO 染色呈黃綠色熒光，濃聚成新月形或顆粒狀，位于細胞的一側。 6．Pae體外給藥對VSMCs凋亡率的影響 Pae作用VSMCs 36h后，流式細胞儀檢測結果表明，Pae 31.25、62.5和120mg/L濃度組的DNA直方圖可見到較明顯的亞二倍體峰（Sub－G1峰），其凋亡率分別為(5.83±0.21)％、(7.14±0.71)％和(6.72±0.39)％；空白對照組的凋亡率為(2.06±0.23)％。Pae31.

10、25、62.5及120mg/L三種濃度組與空白對照組比較凋亡率明顯增加。 7.Pae體外給藥對VSMCs p53、C-myc蛋白表達的影響 Pae 62.5和120mg/L濃度組可使VSMCs的p53蛋白表達顯著增加，而C-myc蛋白表達明顯下調。 結論： 家兔主動脈組織塊經(jīng)0.15％膠原酶液消化6h后貼壁培養(yǎng)的方法可為分子生物學實驗提供足量可靠的細胞來源。Pae一定濃度體內(nèi)、外給藥均可抑制VSMC