HSP60對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴(yán)重危害人類健康。AS的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的緩慢發(fā)展的病生病理過程，其中內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與AS斑塊的形成有著密切的聯(lián)系。
　　 血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)的表型轉(zhuǎn)化和增殖在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作

2、用。VSMC的主要作用是通過舒張和收縮改變血管直徑，使血管保持適當(dāng)?shù)难鲏毫?，此時(shí)的VSMC表現(xiàn)為收縮型表型，其增殖及合成活性很低。在多種病理因素的作用下，VSMC的表型可由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型。研究表明，血管表型轉(zhuǎn)化是高血壓，AS和血管成形術(shù)后再狹窄的心血管疾病VSMC增殖和遷移的關(guān)鍵性始動因素，處于合成狀態(tài)的VSMC能夠合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，而細(xì)胞外基質(zhì)又可影響血管的增殖，黏附和遷移過程。而在生理?xiàng)l件下，VSMC增殖和凋亡之間保持

3、平衡，在許多病理狀態(tài)下可使其增殖失控，從而引起血管壁的一系列變化。眾多研究表明，VSMC增殖在AS病變的形成過程中以及在經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性的作用
　　 熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)作為一類自身免疫原性蛋白，與AS的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。在人AS區(qū)域的血管內(nèi)膜、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均可檢測到HSP60表達(dá)，且HSP60的表達(dá)強(qiáng)度與病變程度呈正相關(guān)

4、。而且在心臟病患者和不同程度的冠狀動脈疾病患者的血清中都有HSP60表達(dá)，患者病情越嚴(yán)重，HSP60表達(dá)水平越高。
　　 盡管VSMC增殖與AS的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，但在AS中VSMC的行為是如何受到調(diào)節(jié)的目前尚不完全清楚。本研究將通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定HSP60與VSMC增殖的關(guān)系，探討HSP60與VSMC細(xì)胞周期的關(guān)系，試圖通過分析HSP60調(diào)控VSMC增殖的相關(guān)機(jī)制研究，為AS發(fā)病機(jī)制的研究提供新的視角及理論基礎(chǔ)。

5、　　 方法:
　　 (1) A7r5細(xì)胞培養(yǎng):A7r5細(xì)胞用含10％胎牛血清和100U/ml的青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期、生長至80％～90％融合率的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn);
　　 (2) MTT方法觀察細(xì)胞增殖變化，檢測不同濃度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激A7r5細(xì)胞24h后，觀察對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，并確定最

6、佳誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的濃度;
　　 (3)利用10ng/ml HSP60刺激VSMC24h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化;
　　 (4)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測CDK4的表達(dá)量;
　　 (5)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100n

7、g/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測cyclinD1的表達(dá)量;
　　 (6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測PCNA的表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 (1) MTT方法觀察細(xì)胞增殖結(jié)果顯示:不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/m

8、l、100ng/ml)刺激細(xì)胞后，在20ng/ml、50ng/ml和100ng/mlHSP60時(shí)細(xì)胞增殖變化不明顯，當(dāng)1ng/ml、10ng/mlHSP60刺激時(shí)，細(xì)胞增殖數(shù)量均明顯增加(P＜0.05)，二者沒有明顯區(qū)別;
　　 (2)10ng/ml HSP60刺激細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測處于細(xì)胞周期中S期的細(xì)胞明顯升高;
　　 (3)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100

9、ng/ml)刺激VSMC后，Western blot檢測CDK4的表達(dá)明顯增加，隨著刺激劑量的加大，CDK4的表達(dá)逐漸增加，其中在100ng/mlHSP60濃度時(shí)，CDK4的表達(dá)量增加最多;
　　 (4)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，Western blot檢測低濃度＜10 ng/ml)HSP60對cyclin D1的表達(dá)基本沒有影響，當(dāng)HSP

10、60濃度大于10 ng/ml時(shí)，cyclin D1的表達(dá)隨著HSP60濃度的增高而增加，具有明顯的劑量依賴性，HSP60的濃度為50ng/ml時(shí)，cyclin D1的表達(dá)量最高，當(dāng)HSP60的濃度大于50ng/ml，反而抑制cyclinD1的表達(dá);
　　 (5)不同濃度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激VSMC后，Western blot檢測PCNA的表達(dá)明顯增加，其

11、中在10ng/ml HSP60濃度時(shí)，PCNA的表達(dá)量增加最多，而在50ng/ml、100ng/mlHSP60濃度時(shí)，PCNA的表達(dá)沒有明顯變化.
　　 結(jié)論:
　　 (1) HSP60能夠誘導(dǎo)血管平滑肌的增殖，且在HSP60小劑量時(shí)與濃度的變化呈正相關(guān)。其中在10ng/ml HSP60刺激下，細(xì)胞的增殖更明顯;
　　 (2) HSP60對血管平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，與其對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān);
　　 (