HSP60對血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制研究.pdf

1、目的:
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴重危害人類健康。AS的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的緩慢發(fā)展的病生病理過程，其中內皮細胞、血管平滑肌細胞、淋巴細胞和巨噬細胞與AS斑塊的形成有著密切的聯系。
　　 血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)的表型轉化和增殖在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作

2、用。VSMC的主要作用是通過舒張和收縮改變血管直徑，使血管保持適當的血流壓力，此時的VSMC表現為收縮型表型，其增殖及合成活性很低。在多種病理因素的作用下，VSMC的表型可由收縮型轉化為合成型。研究表明，血管表型轉化是高血壓，AS和血管成形術后再狹窄的心血管疾病VSMC增殖和遷移的關鍵性始動因素，處于合成狀態(tài)的VSMC能夠合成和分泌大量細胞外基質，而細胞外基質又可影響血管的增殖，黏附和遷移過程。而在生理條件下，VSMC增殖和凋亡之間保持

3、平衡，在許多病理狀態(tài)下可使其增殖失控，從而引起血管壁的一系列變化。眾多研究表明，VSMC增殖在AS病變的形成過程中以及在經皮冠狀動脈介入術后血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機制中起關鍵性的作用
　　 熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)作為一類自身免疫原性蛋白，與AS的發(fā)生發(fā)展有密切關系。在人AS區(qū)域的血管內膜、巨噬細胞和平滑肌細胞均可檢測到HSP60表達，且HSP60的表達強度與病變程度呈正相關

4、。而且在心臟病患者和不同程度的冠狀動脈疾病患者的血清中都有HSP60表達，患者病情越嚴重，HSP60表達水平越高。
　　 盡管VSMC增殖與AS的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，但在AS中VSMC的行為是如何受到調節(jié)的目前尚不完全清楚。本研究將通過體外細胞實驗確定HSP60與VSMC增殖的關系，探討HSP60與VSMC細胞周期的關系，試圖通過分析HSP60調控VSMC增殖的相關機制研究，為AS發(fā)病機制的研究提供新的視角及理論基礎。

5、　　 方法:
　　 (1) A7r5細胞培養(yǎng):A7r5細胞用含10％胎牛血清和100U/ml的青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)，取處于對數生長期、生長至80％～90％融合率的細胞用于實驗;
　　 (2) MTT方法觀察細胞增殖變化，檢測不同濃度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激A7r5細胞24h后，觀察對細胞增殖的調節(jié)作用，并確定最

6、佳誘導細胞增殖的濃度;
　　 (3)利用10ng/ml HSP60刺激VSMC24h后收集細胞，流式細胞術檢測細胞周期的變化;
　　 (4)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測CDK4的表達量;
　　 (5)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100n

7、g/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測cyclinD1的表達量;
　　 (6)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC24h后，利用Western blot檢測PCNA的表達量。
　　 結果:
　　 (1) MTT方法觀察細胞增殖結果顯示:不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/m

8、l、100ng/ml)刺激細胞后，在20ng/ml、50ng/ml和100ng/mlHSP60時細胞增殖變化不明顯，當1ng/ml、10ng/mlHSP60刺激時，細胞增殖數量均明顯增加(P＜0.05)，二者沒有明顯區(qū)別;
　　 (2)10ng/ml HSP60刺激細胞后，流式細胞術檢測處于細胞周期中S期的細胞明顯升高;
　　 (3)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100

9、ng/ml)刺激VSMC后，Western blot檢測CDK4的表達明顯增加，隨著刺激劑量的加大，CDK4的表達逐漸增加，其中在100ng/mlHSP60濃度時，CDK4的表達量增加最多;
　　 (4)不同濃度HSP60(1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)刺激VSMC后，Western blot檢測低濃度＜10 ng/ml)HSP60對cyclin D1的表達基本沒有影響，當HSP

10、60濃度大于10 ng/ml時，cyclin D1的表達隨著HSP60濃度的增高而增加，具有明顯的劑量依賴性，HSP60的濃度為50ng/ml時，cyclin D1的表達量最高，當HSP60的濃度大于50ng/ml，反而抑制cyclinD1的表達;
　　 (5)不同濃度HSP60（1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）刺激VSMC后，Western blot檢測PCNA的表達明顯增加，其

11、中在10ng/ml HSP60濃度時，PCNA的表達量增加最多，而在50ng/ml、100ng/mlHSP60濃度時，PCNA的表達沒有明顯變化.
　　 結論:
　　 (1) HSP60能夠誘導血管平滑肌的增殖，且在HSP60小劑量時與濃度的變化呈正相關。其中在10ng/ml HSP60刺激下，細胞的增殖更明顯;
　　 (2) HSP60對血管平滑肌細胞增殖的促進作用，與其對細胞周期的調節(jié)有關;
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