丹參對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、目的：隨著基礎(chǔ)研究的深入,人們認(rèn)識(shí)到血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)成為心血管疾病藥物治療作用的靶細(xì)胞之一。局部血管損傷后產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),對(duì)刺激VSMC增殖起重要作用[1],故有效阻斷ROS對(duì)VSMC的增殖與凋亡的作用是防治動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的重要措施之一。因此,以VSMC為細(xì)胞模型篩選出有效抑制

2、其生長(zhǎng)增殖而毒副作用較低的藥物并研究其作用機(jī)理,是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。丹參的有效成分主要為丹參的水溶性物質(zhì),具有抑制血小板粘附、聚集、釋放、增加血清cAMP水平,抑制TXA2形成,促進(jìn)PGI2生成,清除氧自由基,抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[2]。本課題利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察丹參對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)等活性氧(ROS)誘導(dǎo)的大鼠VSMC增殖、凋亡的影響,為對(duì)抗H2O2介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：取1

3、80-200g的Wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)胸主動(dòng)脈中膜用組織塊貼壁法以及酶消化法培養(yǎng)VSMC,在倒置相差顯微鏡下觀察VSMC特征性的“峰”和“谷”狀生長(zhǎng),取3～5代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)抗α-SM肌動(dòng)蛋白單抗鑒定陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)85％以上者用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液中加入過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)大鼠VSMC的增殖,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定促VSMC增殖作用最顯著的H2O2濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。注射用丹參(凍干),通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最低實(shí)驗(yàn)濃度以及最佳作用

4、時(shí)間。最后通過(guò)建立H2O2刺激主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的體外模型,丹參作為影響平滑肌細(xì)胞增殖因素,用MTT[35]、免疫組織化學(xué)[33-39]等方法,來(lái)測(cè)定并分析平滑肌細(xì)胞增殖的情況,并且通過(guò)測(cè)量bcl-2和bax蛋白表達(dá)量來(lái)進(jìn)一步分析平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)分組:1)正常對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)的VSMC;2)H2O2刺激對(duì)照組;3)H2O2+丹參低劑量組組;4)H2O2+丹參中劑量組;5)H2O2+丹參高劑量組組。進(jìn)行VSM

5、C增殖與凋亡實(shí)驗(yàn),觀察分析丹參對(duì)活性氧(H2O2)誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠VSMC增殖周期時(shí)相的影響以及凋亡的影響。
　　 結(jié)果：1、取Wistar大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌經(jīng)過(guò)原代和傳代培養(yǎng)成功后,用3-5代處在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行抗α-SM肌動(dòng)蛋白單抗鑒定,85%以上為陽(yáng)性,則可以用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2、H2O2濃度在0.02-180μM范圍內(nèi)對(duì)VSMC具有促進(jìn)增殖的作用,其中當(dāng)H2O2濃度為30μM時(shí),其增殖作用最顯著;當(dāng)濃度超過(guò)

6、225μM以后,與陰性對(duì)照比較,P＜0.01,則說(shuō)明H2O2濃度超過(guò)225μM以后,對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性,抑制VSMC的增殖。在時(shí)間效應(yīng)上,持續(xù)36小時(shí)的刺激后,VSMC的增殖效果最顯著;持續(xù)刺激6小時(shí)后VSMC就開(kāi)始增殖,隨時(shí)間的延長(zhǎng)增殖作用也增強(qiáng),36小時(shí)達(dá)到最強(qiáng),之后就相對(duì)減弱。
　　 3、丹參濃度為0.4mg/ml時(shí)對(duì)VSMC有抑制作用,隨著濃度的增加抑制作用逐步加強(qiáng),到達(dá)3.2mg/ml以后,抑制作用趨于穩(wěn)定;丹參持續(xù)

7、作用36小時(shí)后,對(duì)VSMC的抑制率達(dá)到51.5%,之后對(duì)VSMC的抑制作用趨于穩(wěn)定狀態(tài)。
　　 4、與正常對(duì)照組比較,H2O2刺激對(duì)照組的bcl-2表達(dá)量明顯增加(P＜0.05),而bax表達(dá)卻減少,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與H2O2刺激對(duì)照組比較,丹參中劑量組和丹參高劑量組的bax表達(dá)量明顯增加(P＜0.05),而bcl-2的表達(dá)量明顯減少(P＜0.05),丹參低劑量組的bax表達(dá)量增加,bcl-2表達(dá)量減少,但都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<