高鹽對大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及藥物干預(yù).pdf

1、目的:研究高鹽促大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖效應(yīng)及替米沙坦和辣椒素對該效應(yīng)的影響,并探討其可能的機制。
　　方法:1.整體實驗:雄性Wistar大鼠隨機分為:對照組(給予0.5％NaCl的顆粒飼料),高鹽組(給予4% NaCl的顆粒飼料),高鹽+替米沙坦組(給予4% NaCl的顆粒飼料+替米沙坦),高鹽+辣椒素組(給予4%NaCl的顆粒飼料+0.01%辣椒素),喂養(yǎng)

2、24周;實驗?zāi)┤⌒刂鲃用}進(jìn)行固定、包埋、切片行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色,免疫組織化學(xué)染色檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscular actin,α-SMA)和增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表達(dá),并計算PCNA的陽性率即細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)。2.離體實驗:(1)鹽濃度、給

3、藥量及作用時間的確定:采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠VSMCs,實驗分為對照組(Na+139mmol/L),高鹽組(Na+149mmol/L、159mmol/L、169mmol/L、179mmol/L),高鹽+替米沙坦組(Na+159mmol/l+替米沙坦10﹣8 mol/L、10﹣7mol/L、10﹣6 mol/L、10﹣5 mol/L、10﹣4 mol/L),高鹽+辣椒素組(Na+159mmol/L+辣椒素10﹣8 mol/L、10﹣7m

4、ol/L、10﹣6 mol/L、10﹣5 mol/L、10﹣4 mol/L),DMSO溶媒組(培養(yǎng)基中加入與溶解替米沙坦和辣椒素等體積的DMSO),分別培養(yǎng)24h、48h、72h和96h后, MTT比色法檢測VSMCs活力,計算細(xì)胞的增殖率(proliferation rate, PR)和抑制率(Inhibition rate,IR)。(2)效應(yīng)與機制分析高鹽濃度和給藥量及作用時間由(1)確定。VSMCs去血清同步化24h,分為對照組(

5、Na+139mmol/L),高鹽組(Na+159mmol/L),高鹽+替米沙坦組(Na+159mmol/l+替米沙坦10﹣5 mol/L)和高鹽+辣椒素組(Na+159mmol/L+辣椒素10﹣5 mol/L),繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行以下實驗:流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖周期; HE染色后測量單個細(xì)胞面積、胞漿面積及核面積,并計算出核面積與細(xì)胞面積比值、核面積與胞漿面積比值;免疫熒光檢測大鼠 VSMCs中α-SMA、PCNA、Transform

6、ing growth factor-β1( TGF-β1)、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)檢測大鼠VSMCs中血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡtype1,AT1R)、血管緊張素Ⅱ2型受體(angiotensinⅡtype2,AT2R)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1(angiotensin-converting enzyme, ACE)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzym

7、e2,ACE2)、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngII)蛋白表達(dá);Real time RT-PCR檢測大鼠VSMCs中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、AT1R、AT2R、ACE mRNA的表達(dá),
　　結(jié)果:1.整體實驗胸主動脈HE染色可見,高鹽組動脈中膜厚度、中膜厚度與腔徑比值均升高,替米沙坦可改善上述病理變化,但辣椒素未見明顯影響。高鹽可降低胸主動脈α-SMA的表達(dá)量(P<0.05),與高鹽組相比

8、,替米沙坦和辣椒素未見明顯影響。高鹽組PI明顯增高(P<0.05),經(jīng)替米沙坦和辣椒素干預(yù)后PI顯著降低。2.離體實驗:(1)鹽濃度、給藥量及作用時間的確定 MTT結(jié)果顯示Na+終濃度為159mmol/L作用72h促VSMCs增殖效應(yīng)最明顯,且鹽濃度與細(xì)胞增殖之間存在時效與量效關(guān)系,替米沙坦和辣椒素抗增殖作用最佳濃度均為10﹣5 mol/L。(2)效應(yīng)與機制分析高鹽(159mmol/L)作用72h后,OD值和PR值均升高,PCNA蛋白表

9、達(dá)增加,該效應(yīng)可被替米沙坦和辣椒素拮抗,α-SMA表達(dá)顯著降低,替米沙坦和辣椒素對其無影響。高鹽組 HE染色可見高鹽組大鼠VSMCs的細(xì)胞面積、核面積、胞漿面積明顯增加(P<0.05),而核面積與胞漿面積比值、核面積與細(xì)胞面積比值降低(P<0.05),G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.05), S期細(xì)胞比例增多(P<0.05),替米沙坦和辣椒素對上述改變均有改善作用。在高鹽組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和TGF-β1、

10、p-Smad2/3蛋白表達(dá)增高,而Smad7與之相反,替米沙坦和辣椒素對上述改變均有改善作用。在高鹽組AT1、AT2、ACE mRNA和AT1、AT2、ACE、AngII蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05),而ACE2蛋白表達(dá)減少(P<0.05),替米沙坦可顯著改善AT1、AT2、ACE mRNA和蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)論:(1)長期(24w)高鹽飲食可導(dǎo)致主動脈重塑,其特征為動脈中膜增厚、血管平滑肌增殖和表型轉(zhuǎn)換。(2)高鹽能誘導(dǎo)大鼠