Geminin基因RNA干擾對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制初探.pdf

1、一、研究背景
　　 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、遷移及其合成細(xì)胞外基質(zhì)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形后再狹窄等增生性血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)，但目前就其具體的發(fā)病機(jī)制研究得還不甚清楚，有相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致啟動(dòng)上述病理過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對(duì)血管平滑肌增殖的影響，探討血管增生性疾病的發(fā)病機(jī)制已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)，新近發(fā)現(xiàn)的一種被稱為多功能小分子蛋白

2、Geminin在真核細(xì)胞增殖一分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用。提示這個(gè)基因可能參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。但是Geminin對(duì)VSMCs增殖影響如何？是否通過(guò)調(diào)控表型影響增殖？知之甚少。本研究對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞Geminin進(jìn)行干擾，觀察和分析其對(duì)VSMCs增殖及其表型的影響。為其運(yùn)用于動(dòng)脈粥樣硬化及其血管成形術(shù)后再狹窄的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 通常情況下，VSMCs存在兩種表型，即去分化表型(合成表型)與分化表型(

3、收縮表型)，在一定的條件下，兩種表型可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，正常成人的血管動(dòng)脈壁由內(nèi)膜，中膜和外膜三層構(gòu)成。VSMCs主要位于中膜且呈分化表型，當(dāng)受到外界的刺激如內(nèi)皮受到損傷或是體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其表型可由分化型向去分化型轉(zhuǎn)化，并向內(nèi)膜遷移、增殖。合成型VSMCs分化程度較低，處于這種表型的細(xì)胞可以合成血管活性物質(zhì)和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與血管損傷的修復(fù)，在生長(zhǎng)因子刺激下，可發(fā)生分裂和增殖。VSMCs表型的轉(zhuǎn)化是其增殖的前提，此外VSMCs的增殖還

4、受起始復(fù)合物的調(diào)控，而ORC1和Cdt1是起始復(fù)合物組成的關(guān)鍵因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理作用。
　　 細(xì)胞進(jìn)行增殖時(shí)其表型會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，Geminin是否參與了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控，與細(xì)胞增殖有何關(guān)系？目前認(rèn)為DNA的復(fù)制是細(xì)胞增殖的基本特征，而起始復(fù)合物是真核生物復(fù)制的起始蛋白，在DNA復(fù)制的過(guò)程中只有起始復(fù)合物的成功組建才能確保DNA復(fù)制的順利進(jìn)行，因此我們推測(cè)Geminin可能是通過(guò)影響起始復(fù)合物的形成從而起

5、到調(diào)控VSMCs的表型轉(zhuǎn)化與增殖的作用。
　　 二、研究目的
　　 1.本研究通過(guò)對(duì)Geminin基因進(jìn)行干擾觀測(cè)該基因?qū)SMCs表型轉(zhuǎn)化及其增殖的影響。并初步探討Geminin基因影響VSMCs增殖的相關(guān)機(jī)制。
　　 三、研究方法
　　 1.構(gòu)建三組針對(duì)VSMCs Geminin基因的干擾序列并篩選出干擾效果最為顯著的序列用于構(gòu)建慢病毒包裹的穩(wěn)定干擾模型。
　　 2.血清刺激誘導(dǎo)細(xì)胞處于分化表

6、型，分別利用RT-PCR，Western blot方法檢測(cè)VSMCs中Geminin基因、蛋白表達(dá)的變化。
　　 3.對(duì)Geminin進(jìn)行干擾后，利用Western blot方法檢測(cè)VSMCs表型標(biāo)志物的變化并應(yīng)用[3H]-TdR、EdU摻入試驗(yàn)觀測(cè)VSMCs增殖的情況。
　　 4.通過(guò)阻斷Gemimn基因觀測(cè)起始復(fù)合物ORC1；Cdt1表達(dá)的變化，并利用免疫熒光及免疫共沉淀的方法研究?jī)烧咧g的相互關(guān)系。
　　

7、四、研究結(jié)果
　　 1、將三段針對(duì)Geminin基因的干擾序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以第1亞組干擾效果最為顯著：其表達(dá)量較其余兩陽(yáng)性亞組及對(duì)照組比較有顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并將第一亞組干擾序列成功構(gòu)建慢病毒干擾模型。
　　 2、對(duì)處于分化表型的VSMCsGeminin進(jìn)行干擾，檢測(cè)其不同表型標(biāo)志物的變化發(fā)現(xiàn)：收縮型表型標(biāo)志物α-actin明顯下降，合成型標(biāo)志物OPN表達(dá)顯著升高，初步驗(yàn)證Geminin基因參與了VS

8、MCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。
　　 3、VSMCsGeminin基因沉寂后，與兩對(duì)照組相比較，陽(yáng)性干擾組的[3H]-TdR和EdU摻入量顯著增加，說(shuō)明Geminin基因可抑制VSMCs的增殖。
　　 4、對(duì)Geminin基因進(jìn)行沉默后，與空白及陰性對(duì)照組相比較，陽(yáng)性干擾組中起始復(fù)合物ORC1，Cdt1的表達(dá)量有顯著增加，免疫熒光及免疫共沉淀結(jié)果提示Geminin蛋白與Cdt1蛋白存在著直接相互作用。
　　 五、結(jié)論