長鏈非編碼RNA PUNISHER對(duì)血管平滑肌細(xì)胞作用及其機(jī)制探究.pdf

1、目的：探究長鏈非編碼RNA PUNISHER對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系?
　　方法：12只健康純種雄性4周齡載脂蛋白E（apolipoprotein, ApoE）基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)通過高脂飼喂制/作動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠（模型組）12只健康C57BL/6J小鼠飼以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組；人體血管平滑肌細(xì)胞系（HA-VSMC）根據(jù)轉(zhuǎn)染情況分為小干擾-PUNISHER組和陰性對(duì)照（negative

2、 control, NC）組。通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定模型組與對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈弓的PUNISHER表達(dá)；通過合成PUNISHER的小干擾RNA作為反向?qū)φ找种芇UNISHER在人血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證PUNISHER表達(dá)情況；分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8, cck-8）、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及線粒體染色檢測抑制PUNISHER表達(dá)對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和

3、線粒體分裂情況的影響；蛋白印跡法檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell leukemia-lymphoma-2, Bcl-2）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinylaspartae specific proteinase3, caspase3）、caspase8、p-p38、p53、OPA1等蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）血脂四項(xiàng)及血管蘇木精-伊紅染色（HE染色）證明動(dòng)脈粥樣硬化模型制作成功。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯

4、示，動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血管的PUNISHER表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.597, P＜0.05）；（2）CCK-8法檢測顯示si-PUNISHER組的吸光度值在轉(zhuǎn)染36h后低于NC組，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t36=2.638, P＜0.05, t48=2.554, P＜0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示si-PUNISHER組細(xì)胞遷移率低于NC組（t=3.136 P＜0.05）(3)流式細(xì)胞術(shù)顯示si-PUNISHER組中血管平滑肌細(xì)

5、胞的凋亡細(xì)胞數(shù)多于NC組（x2=4.245, P＜0.05）；（4）經(jīng)線粒體染色，共聚焦顯微鏡下觀察到si-PUNISHER組細(xì)胞線粒體分裂明顯多于NC組（5）蛋白印跡法顯示si-PUNISHER組bcl-2、caspase330kD和p53蛋白表達(dá)明顯低于NC組（tbcl-2=9.546, P＜0.05, tcapase330KD=5.647, P＜0.05, tp53=5.42, P＜0.05），caspase317kD，OPA1蛋