ROCKⅠ對(duì)PDGF介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是威脅人類健康的主要疾病之一,對(duì)于AS發(fā)病機(jī)制一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn)。其中血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)由中膜層向內(nèi)膜下間隙遷移并導(dǎo)致異常增生是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。PDGF作為一種強(qiáng)有力的體外趨化劑,可以誘導(dǎo)VSMC增殖和遷移。ROCK是Rho下游靶效應(yīng)分子,分ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種亞型,參與細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架重組等多種細(xì)胞行為,而這些功能又參與許多心血管疾病

2、的發(fā)生、發(fā)展,而ROCK參與細(xì)胞遷移的分子機(jī)制尚不十分清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道,MAPK家族成員參與細(xì)胞的增殖和遷移,如p38 MAPK,ERK(胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)。此外在細(xì)胞遷移過(guò)程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以廣泛降解ECM,為VSMC的遷移掃清道路,促進(jìn)VSMC的遷移。本實(shí)驗(yàn)研究目的在于通過(guò)PDGF介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移的模型,闡述ROCKⅠ亞型調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞研究的分子機(jī)制,為闡明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　

3、方法:(1)利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法過(guò)表達(dá)ROCKⅠ,通過(guò)RNA和蛋白水平檢測(cè)ROCKⅠ的表達(dá)情況;(2)利用Boyden chamber和劃痕方法,檢測(cè)ROCKⅠ過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞的遷移情況;(3)利用Westem blot方法,在10ng/ml PDGF刺激下,檢測(cè)p-ERK和p-p38在不同時(shí)間的表達(dá)情況;(4)利用Westem blot方法,在不同濃度U0126(ERK抑制劑)和SB203580(p38抑制劑)處理下,檢測(cè)p-ER

4、K和p-p38表達(dá)情況;(5)利用Boyden chamber法,在不同濃度U0126和SB203580處理下,檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移的影響;(6)利用Westem blot和明膠酶譜法,檢測(cè)U0126和SB203580對(duì)MMP2蛋白表達(dá)和活性的影響;(7)利用免疫熒光方法,在不同濃度U0126和SB203580處理下,檢測(cè)抑制劑對(duì)細(xì)胞偽足形成的影響。
　　 結(jié)果:(1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ROCKⅠ過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞遷移明顯增加;(2)PDGF(10

5、ng/ml)刺激下,p-ERK和p-p38表達(dá)水平分別出現(xiàn)峰值;(3)不同濃度U0126和SB203580處理下,p-ERK和p-p38表達(dá)隨濃度依賴性下降;(4)在不同濃度U0126和SB203580處理下,細(xì)胞遷移能力隨濃度依賴性下降;(5)U0126和SB203580均降低MMP2的蛋白表達(dá)和活性;(6)U0126和SB203580減少細(xì)胞偽足的形成。
　　 結(jié)論:(1)進(jìn)一步證實(shí)ROCKⅠ與血管平滑機(jī)細(xì)胞的遷移密切相關(guān);