OCT4對血管平滑肌細胞增殖遷移及血管新生內膜增生的作用及機制.pdf

1、近年來，經皮冠狀動脈介入治療(PCI)已經廣泛的用于治療血管壁粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄。然而，有相當一部分患者術后發(fā)生病變處血管的再狹窄，從而降低了PCI的療效，并且增加再發(fā)心血管事件的風險。
　　目前認為損傷血管修復過程中，新生內膜的異常增生是發(fā)生PCI術后再狹窄的病理生理基礎。而血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力的增強，是血管損傷后新生內膜增生，從而導致管腔狹窄的重要原因。而血管平滑肌細胞具有顯著的表觀可塑性，使其可快速適應周圍

2、環(huán)境的改變。當受到細胞外基質成分、細胞因子、剪切力、氧自由基等因素的刺激后，血管平滑肌細胞會顯著降低血管平滑肌細胞分化標志物的表達，提高增殖，遷移和合成的細胞外基質的能力，以參與新生內膜的形成。血管平滑肌細胞表型的開關在血管疾病中發(fā)揮重要的作用，因此，認識血管平滑肌細胞表型轉化的分子機制，有可能為防治PCI術后再狹窄提供調控的靶點。
　　OCT4由Pou5fl基因編碼產生，主要定位于細胞核，其在胚胎干細胞及間充質干細胞等未/低分化

3、細胞高表達，而在高度分化的成體細胞正常情況下則幾乎不表達。近年來，隨著對OCT4研究的深入，發(fā)現OCT4除了在干細胞和生殖細胞腫瘤中高表達以外，還在非生殖系統(tǒng)的腫瘤細胞中同樣有表達。不僅如此，OCT4甚至在成體細胞和異位的子宮內膜組織中再表達，并且使腫瘤細胞和成體細胞表現出易于遷移和增殖的表型。這些研究結果提示，OCT4極可能在某些病理狀態(tài)下被激活，從而在細胞去分化的過程中起到重要的作用，并使得細胞表現出更容易增殖、遷移等具有去分化表型

4、的能力。
　　目前，在心血管疾病的發(fā)病機制研究中，關于OCT4的作用鮮有報道。本課題旨在通過在體外和體內實驗，觀察OCT4對細胞增殖和遷移的調節(jié)作用，以及對下游靶基因的調控機制。
　　目的：
　　1、刺激人主動脈平滑肌細胞，檢測OCT4的表達，并通過過表達和抑制的方法觀察OCT4對血管平滑肌細胞增殖遷移的影響;2、在小鼠頸動脈損傷模型上觀察OCT4對血管新生內膜增殖的調節(jié);3、用生物學方法檢測與OCT4可能相互作用的靶

5、基因，明確其對血管平滑肌細胞功能的調控作用。
　　方法：
　?。ㄒ唬┑谝徊糠?br>　　用腫瘤壞死因子-α，白介素-1-β，血小板衍生生長因子-BB，轉化生長因子-β刺激人主動脈平滑肌細胞，用定量PCR和western blot的方法檢測OCT4的表達情況。在血管平滑肌細胞中過表達和抑制OCT4，用CCK-8、平板劃線，transwell實驗的方法檢測OCT4在血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用。
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6、r>　　建立小鼠頸總動脈損傷模型，小鼠隨機分為以下幾組:1、頸動脈損傷組;2、頸動脈損傷+OCT4腺病毒轉染組;3、頸動脈損傷+GFP腺病毒轉染組;4、頸動脈損傷+ siRNAOCT4轉染組;5、頸動脈損傷+siRNACTRL轉染組，對側血管作為Sham對照。分別在損傷后3天，7天，14天處死老鼠，做組織切片HE染色，免疫組化，定量PCR等，并測量小鼠內膜和中膜的面積，計算內膜/中膜比值。在小鼠損傷血管中，對OCT4的表達做定位和定量分

7、析。在小鼠損傷血管過表達和抑制OCT4的表達，用組織切片HE染色，定量PCR等實驗方法，檢測OCT4在血管新生內膜形成中的作用。
　?。ㄈ┑谌糠?br>　　在血管平滑肌細胞中過表達OCT4，用定量PCR的方法用篩選在血管平滑肌細胞中可能受到OCT4調控的靶基因。選擇下游基因進行細胞功能測試。
　　結果：
　?。ㄒ唬┑谝徊糠?br>　　血管平滑肌細胞中OCT4的mRNA水平在白介素-1-β，腫瘤壞死因子-α，PDGF

8、-BB，轉化生長因子-β刺激下，發(fā)生不同程度的改變。PDGF-BB刺激血管平滑肌細胞，誘導OCT4表達呈時間和劑量依賴性。在血管平滑肌細胞過表達OCT4，平板劃線和transwell實驗結果提示轉染Ad-OCT4的血管平滑肌細胞遷移數量較轉染Ad-GFP的細胞多，CCK-8結果提示轉染Ad-OCT4的血管平滑肌細胞增殖的數量較轉染Ad-GFP的細胞多。siRNA轉染PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞，轉染siRNAOCT4的血管平滑肌細

9、胞遷移數量較轉染siRNACTRL的細胞少，CCK-8結果提示轉染siRNAOCT4的血管平滑肌細胞增殖的數量較轉染siRNACTRL的細胞少。
　?。ǘ┑诙糠?br>　　1、在小鼠頸動脈損傷后14天的頸動脈橫切片上，經免疫熒光雙標染色顯示OCT4表達在新生內膜血管平滑肌細胞中，且為核表達。OCT4特異性抗體對組織切片進行免疫組化染色顯示OCT4在損傷后第7天在新生內膜有表達，14天在內膜的表達較第7天顯著增加，提示OCT4的

10、表達隨損傷時間而增多。損傷血管的OCT4的mRNA水平較未損傷的對照組升高(P＜0.05)。
　　2、轉染Ad-OCT4腺病毒組，損傷的小鼠頸動脈血管內膜面積(32.45±1.82)×103μm2明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(21.48±0.75)×103μm2(P＜0.05)。轉染Ad-OCT4腺病毒組新生內膜/中膜的比值(1.03±0.07)明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(0.74±0.06;P＜0.05)。
　　

11、3、未損傷組的小鼠血管內彈力板完整，管壁光滑，無內膜增生;siRNA OCT4或者siRNACTRL。siRNACTRL轉染損傷的小鼠頸動脈組可見中膜內排列紊亂的平滑肌細胞，血管平滑肌細胞的細胞核明顯增大變圓，損傷血管內膜可見彌漫性增厚，伴有明顯管腔的縮小。而轉染siRNA OCT4組盡管也可見中膜平滑肌細胞排列紊亂，但損傷血管內膜彌漫性增厚的程度較前者較輕，且管腔的縮小明顯較輕。血管內膜面積(4.95±1.54)×103μm2明顯小于

12、siRNACTRL組(23.53±2.18)×103μm2(P＜0.05)。新生內膜/中膜比值也明顯小于siRNACTRL組(0.19±0.06 VS0.89±0.14; P＜0.05)。
　?。ㄈ┑谌糠?br>　　1、在過表達OCT4的血管平滑肌細胞中，表達升高達到統(tǒng)計學差異的基因有:Sox2, Nanog, BMP4, Etv5, Etv1, Foxd3, KLF4, KLF5, Gadd45a, MMP2, MMP9;表

13、達下降達到統(tǒng)計學差異的基因有:TCF3，Vegfc，DUSP27，Tns3，Psme4。
　　2、MMP2在過表達OCT4的血管平滑肌細胞細胞中，RNA水平和蛋白水平均顯著升高。siRNA MMP2轉染組血管平滑肌細胞的增殖較對照組降低但未達到統(tǒng)計學差異，轉染了siRNA MMP2以后，穿過劃線的平滑肌細胞較對照組的數量顯著降低，穿過小室的平滑肌細胞也較對照組的數量顯著降低。
　　結論：
　　1.不同刺激因子使血管平滑

14、肌細胞的OCT4的表達發(fā)生變化。OCT4促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移。抑制OCT4表達可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移。
　　2.OCT4在小鼠頸動脈損傷模型中升高，主要在新生內膜的血管平滑肌細胞中表達。過表達OCT4促進小鼠頸動脈損傷的新生內膜的增生。下調OCT4抑制小鼠頸動脈損傷的新生內膜的增生。
　　3.OCT4調控血管平滑肌細胞，是通過對一些基因的調節(jié)。MMP2作為OCT4的下游基因，參與了OCT4調控的血管平滑