單核細(xì)胞微泡對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景:
　　隨著全球人口老齡化趨勢(shì)以及人群生活方式、環(huán)境等的改變,心血管疾病發(fā)病率日趨增加,心血管疾病已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的主要疾病之一,明確心血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)其防治具有重要意義。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)異常增殖是心血管疾病關(guān)鍵性病理生理機(jī)制之一。正常狀態(tài)下,VSMCs存在于血管壁中膜,在動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)等疾病狀態(tài)下,

2、VSMCs能夠從中膜遷移至內(nèi)膜,并出現(xiàn)異常增殖,導(dǎo)致血管內(nèi)膜的增厚與管腔狹窄。然而,VSMCs增殖的機(jī)制尚未完全闡明,深入研究VSMCs的增殖機(jī)制,并以此尋找潛在的治療靶點(diǎn),具有重要的臨床意義。
　　近年來(lái)研究顯示炎癥與心血管疾病密切相關(guān)。心血管疾病被認(rèn)為是一種慢性低級(jí)別炎癥或稱(chēng)亞臨床炎癥狀態(tài),炎癥在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展以及進(jìn)一步造成靶器官損害的過(guò)程中起著重要的作用。單核/巨噬細(xì)胞是炎癥介質(zhì)的主要來(lái)源細(xì)胞,既往研究表明單核/巨噬

3、細(xì)胞參與VSMCs增殖。機(jī)體受到炎癥刺激后,激活血液中的單核/巨噬細(xì)胞,生成并釋放多種細(xì)胞毒素,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,內(nèi)皮基質(zhì)暴露,繼而誘導(dǎo)血小板的粘附、聚集?；罨难“遽尫哦喾N的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子(如:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等),啟動(dòng)VSMCs增殖并參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展。而其后

4、有研究發(fā)現(xiàn),敗血癥家兔在內(nèi)皮細(xì)胞受損、血小板粘附前,中膜平滑肌細(xì)胞已開(kāi)始向內(nèi)膜增殖、遷移,單核/巨噬細(xì)胞是否除了通過(guò)分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等方式作用于VSMCs外,還存在其他作用方式?
　　微泡(Extracellular vesicles,EVs)是近年來(lái)日益受到研究者們重視的一種細(xì)胞間通訊介質(zhì)。EVs由磷脂雙分子層包裹而成,表面攜帶母體細(xì)胞來(lái)源的的抗原、脂質(zhì)等,其內(nèi)含有多種母體細(xì)胞成分,包括細(xì)胞膜受體、骨架蛋白、信號(hào)分子等蛋白

5、質(zhì),膽固醇、鞘磷脂等脂類(lèi)以及DNA、mRNA、miRNA等核酸成分,可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)功能,在細(xì)胞間相互作用及信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。在正常狀態(tài)下機(jī)體中EVs含量相對(duì)穩(wěn)定,在某些病理?xiàng)l件下, EVs分泌可以顯著增加。嚴(yán)重的高血壓患者中,內(nèi)皮細(xì)胞以及單核來(lái)源的EVs均明顯升高,且EVs含量與血壓呈明顯正相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型血管壁中EVs含量增加,同時(shí)伴有大血管炎癥、氧化應(yīng)激與微血管內(nèi)皮功能受損。單核細(xì)胞是機(jī)體

6、EVs的重要來(lái)源細(xì)胞之一,單核細(xì)胞是否可以通過(guò)其分泌的EVs參與VSMCs異常增殖這一心血管疾病重要的病理生理機(jī)制目前尚不明確。我們推測(cè):單核細(xì)胞可能通過(guò)分泌EVs作用于VSMCs,引起VSMCs異常增殖,進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　本研究將人主動(dòng)脈VSMCs(human aortic VSMCs,HA-VSMCs)與單核細(xì)胞來(lái)源的EVs共培養(yǎng),觀察EVs對(duì)VSMCs增殖的影響并進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制,為尋找干預(yù)心血

7、管疾病的有效靶點(diǎn)提供新的的理論基礎(chǔ)。
　　二、研究目的:
　　明確單核細(xì)胞分泌的EVs對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響,并進(jìn)一步探尋其機(jī)制。
　　三、研究方法:
　　1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells,HA-VSMCs細(xì)胞)、人單核細(xì)胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)的培養(yǎng);
　　2.根據(jù)以往文

8、獻(xiàn)報(bào)道[1][2],采用多步差速離心法提取EVs;
　　3.透射電鏡對(duì)EVs的形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定,流式細(xì)胞術(shù)對(duì)EVs的數(shù)量進(jìn)行比對(duì)[3],免疫印跡的方法對(duì)EVs的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行鑒定;
　　4.將單核細(xì)胞給予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)處理后提取EVs,以模擬體內(nèi)炎癥狀態(tài),使單核細(xì)胞充分活化;
　　5.采用單核細(xì)胞EVs及LPS刺激單核細(xì)胞后提取的EVs(LPS-EVs)與VSMCs細(xì)胞共培養(yǎng),用細(xì)

9、胞計(jì)數(shù)、[3H]-TdR和CCK-8方法,了解VSMCs增殖的情況;
　　6.免疫印跡的方法檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號(hào)通路磷酸化以及c-jun與c-fos的表達(dá),觀察單核EVs是否通過(guò)此通路對(duì)VSMCs增殖產(chǎn)生影響。
　　四、研究結(jié)果:
　　1.單核細(xì)胞EVs可以促進(jìn)VSMCs增殖,且呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性,經(jīng)LPS刺激后的單核細(xì)胞EVs促V