ROCK-Ⅱ基因表達(dá)下調(diào)與血管平滑肌細(xì)胞遷移的關(guān)系.pdf

1、目的: 動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重威脅人類健康，是威脅人類健康的主要原因，在我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增生和遷移，是形成動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素之一。血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)是一個(gè)主要的促細(xì)胞分裂原，是引起動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素，它的主要作用是促進(jìn)平滑肌細(xì)胞由中層向內(nèi)層的遷移。PDGF-BB是已知最強(qiáng)的VSMC體外趨化劑。Rho激酶(ROCK)是小G蛋白下游的效應(yīng)器之一，有兩種異構(gòu)體：R

2、OKα/ROCK-Ⅱ和ROKβ/ROCK-I。大量研究表明，RhoA/Rho激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了眾多血管生理功能的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞骨架重組、平滑肌收縮、細(xì)胞增生、黏附和遷移以及其他炎性反應(yīng)過(guò)程，而這些細(xì)胞功能又與許多血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，Rho激酶有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、高血壓、腦或冠脈血管痙攣等血管疾病的重要靶點(diǎn)。 本文旨在探討ROCK-Ⅱ在血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)的VSMC遷移中的作用。

3、通過(guò)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，使ROCK-Ⅱ基因表達(dá)下調(diào)，從而觀察VSMC遷移是否發(fā)生變化，進(jìn)而為探尋平滑肌收縮的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床防治動(dòng)脈粥樣硬化等增生性血管病的新藥研發(fā)提供新思路。 方法: 1．根據(jù)在GenBank中查到大鼠ROCK-Ⅱ基因序列(GenBankNM-013022)，自行設(shè)計(jì)siRNA片段序列，采用化學(xué)合成法合成siRNA(編號(hào)為CBR0915)。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中還使用由本實(shí)驗(yàn)室從Santa Cruz

4、公司購(gòu)置的小鼠ROCK-Ⅱ siRNA(sc-36433)。 2．采用invitrogen公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000，將siRNA轉(zhuǎn)染至VSMC內(nèi)，同時(shí)使用綠色熒光素標(biāo)記的Control siRNA(Fluorescein Conjiugate)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察siRNA轉(zhuǎn)染狀況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率并確定轉(zhuǎn)染時(shí)間，通過(guò)脂質(zhì)體毒性實(shí)驗(yàn)，確定最佳的轉(zhuǎn)染試劑用量。 3．用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，

5、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照，分析并計(jì)算目的條帶與GAPDH擴(kuò)增條帶光密度比值作為其相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。 4．收集細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)蛋白濃度，電泳轉(zhuǎn)膜后，經(jīng)過(guò)抗體孵育，化學(xué)反光法檢測(cè)蛋白條帶，進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算ROCK-Ⅱ與β-actin比值。 5．采用Boyden小室法進(jìn)行VSMC的遷移實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中，設(shè)空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)、脂質(zhì)體組(僅加入脂質(zhì)體組)和RNA干擾組，觀

6、察RNA干擾ROCK-Ⅱ基因表達(dá)前后A7r5遷移數(shù)量的變化。 結(jié)果: 1．在熒光顯微鏡下，觀察熒光素標(biāo)記的Control siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，可見到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)清晰的綠色熒光，在轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率接近92％。 2．在脂質(zhì)體毒性實(shí)驗(yàn)中，加入1.7μ1脂質(zhì)體使A7r5細(xì)胞減少了46.9％，加入2.5μ1脂質(zhì)體使細(xì)胞減少了66.2％。 3．經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)，得

7、到如下結(jié)果：(1)用小鼠siRNA不能下調(diào)ROCK-Ⅱ mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；(2)用17nM大鼠siRNA可以使ROCK-Ⅱ mRNA表達(dá)量減少了60.3％(P<0.05)。提示大鼠siRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ基因的表達(dá)。 4．Western blot結(jié)果顯示：(1)小鼠siRNA不能下調(diào)ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；(2)17n

8、M大鼠siRNA可使ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)量減少了60.1％。提示大鼠ROCK-ⅡsiRNA可以有效抑制ROCK-Ⅱ蛋白的表達(dá)。 5．VSMC的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)通過(guò)不同濃度PDGF-BB誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞遷移，根據(jù)細(xì)胞遷移數(shù)量，確定了PDGF-BB誘導(dǎo)劑使用濃度為5ng/ml。(2)在A7r5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組A7r5細(xì)胞遷移數(shù)為70.2±8.81(n=3)，脂質(zhì)體組A7r5細(xì)胞遷移數(shù)為59.3±6.22(n=3)，

9、17nMsiRNA組A7r5細(xì)胞遷移數(shù)為60.1±4.11(n=3)。實(shí)驗(yàn)表明加入大鼠ROCK-ⅡsiRNA后細(xì)胞遷移數(shù)量較空白對(duì)照組和單純用脂質(zhì)體組均未見明顯變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論: 1．確定了ROCK-Ⅱ siRNA的最佳用量為17nM，最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為5小時(shí)。 2．利用自行設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠ROCK-Ⅱ的siRNA轉(zhuǎn)染A7r5血管平滑肌細(xì)胞，在基因水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)可以