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文檔簡介
1、目的:研究線粒體融合蛋白-2(Mitofusin-2,Mfn2)對大鼠主動脈血管平滑肌細胞(rat vascular smooth muscle cells,rVSMCs)周期及細胞周期調(diào)控蛋白表達水平的影響,探討其可能機制。
方法:體外培養(yǎng)rVSMCs,隨機分為5組,以胸腺嘧啶核苷(thymidine)和諾考達唑(nocdazol)干預,分別作用不同時間,利用雙胸苷阻斷和血清饑餓法使rVSMCs達到細胞同步化,收集G0/
2、G1期、G1/S期、S期和G2/M期平滑肌細胞,光學顯微鏡觀察rVSMCs的形態(tài)學變化,流式細胞儀鑒定細胞周期;利用免疫印記(Western-Blot)方法檢測Mfn2以及Ras信號通路中胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白表達和細胞周期調(diào)控因子Cyclin D、Cyclin E及CDK1的活性,并分析其相關(guān)性。
結(jié)果:(1)光學顯微鏡觀察藥物對rVSMCs生長的影響:
隨著胸苷阻斷與釋放不同時間
3、,G1/S期和S期細胞體積比非干預組稍增大,顯示其正處于DNA合成期,G2/M期絕大部分細胞變大變圓,顯示其正處于有絲分裂階段,G0/G1期細胞形態(tài)與非干預組相比無明顯差異。
(2)流式細胞儀鑒定細胞周期:
采用血清饑餓法、雙胸苷阻斷法和諾考達唑阻抑法分別獲得了同步化的rVSMCs,各組DNA含量百分比均達到要求。血清饑餓法得到以G0/G1期為主的rVSMCs細胞群(P<0.01),提示rVSMCs主要同步化
4、于靜止期;雙胸苷阻斷14h得到以G1/S期為主的細胞群(P<0.05),提示rVSMCs主要同步化于G1/S交界期;雙胸苷阻斷14 h后以10%小牛血清刺激6 h后細胞群以S期為主(P<0.01),提示rVSMCs主要同步化于S期即DNA合成期;諾考達唑阻滯12h得到以G2/M期為主的細胞群(P<0.01),提示rVSMCs主要同步化于G2/M期。
(3)免疫印記(Western-Blot)方法檢測Mfn2、ERK1/2、
5、Cyclin D、Cyclin E及CDK1的水平變化:Mfn2在細胞靜止期(G0/G1期)表達量顯著高于增殖期(S期和G2/M期),其下游蛋白Erk1/2與之相反,增殖期表達量顯著高于靜止期;Cyclin D與Cyclin E在G1/S及S期表達明顯增強,CDK1在G2/M期表達明顯增強。
結(jié)論:(1)Mfn2表達量隨細胞的分裂周期而變化;
(2)Mfn2通過Ras/Raf/MEK/Erk信號傳導通路參與細
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