Mfn2基因?qū)ρ芷交〖?xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：研究線粒體融合蛋白-2(Mitofusin-2，Mfn2)對大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(rat vascular smooth muscle cells，rVSMCs)周期及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響，探討其可能機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)rVSMCs，隨機(jī)分為5組，以胸腺嘧啶核苷(thymidine)和諾考達(dá)唑(nocdazol)干預(yù)，分別作用不同時(shí)間，利用雙胸苷阻斷和血清饑餓法使rVSMCs達(dá)到細(xì)胞同步化，收集G0/

2、G1期、G1/S期、S期和G2/M期平滑肌細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡觀察rVSMCs的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞周期；利用免疫印記(Western-Blot)方法檢測Mfn2以及Ras信號通路中胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D、Cyclin E及CDK1的活性，并分析其相關(guān)性。
　　 結(jié)果：(1)光學(xué)顯微鏡觀察藥物對rVSMCs生長的影響：
　　 隨著胸苷阻斷與釋放不同時(shí)間

3、，G1/S期和S期細(xì)胞體積比非干預(yù)組稍增大，顯示其正處于DNA合成期，G2/M期絕大部分細(xì)胞變大變圓，顯示其正處于有絲分裂階段，G0/G1期細(xì)胞形態(tài)與非干預(yù)組相比無明顯差異。
　　 (2)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞周期：
　　 采用血清饑餓法、雙胸苷阻斷法和諾考達(dá)唑阻抑法分別獲得了同步化的rVSMCs，各組DNA含量百分比均達(dá)到要求。血清饑餓法得到以G0/G1期為主的rVSMCs細(xì)胞群(P<0.01)，提示rVSMCs主要同步化

4、于靜止期；雙胸苷阻斷14h得到以G1/S期為主的細(xì)胞群(P<0.05)，提示rVSMCs主要同步化于G1/S交界期；雙胸苷阻斷14 h后以10％小牛血清刺激6 h后細(xì)胞群以S期為主(P<0.01)，提示rVSMCs主要同步化于S期即DNA合成期；諾考達(dá)唑阻滯12h得到以G2/M期為主的細(xì)胞群(P<0.01)，提示rVSMCs主要同步化于G2/M期。
　　 (3)免疫印記(Western-Blot)方法檢測Mfn2、ERK1/2、

5、Cyclin D、Cyclin E及CDK1的水平變化：Mfn2在細(xì)胞靜止期(G0/G1期)表達(dá)量顯著高于增殖期(S期和G2/M期)，其下游蛋白Erk1/2與之相反，增殖期表達(dá)量顯著高于靜止期；Cyclin D與Cyclin E在G1/S及S期表達(dá)明顯增強(qiáng)，CDK1在G2/M期表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：(1)Mfn2表達(dá)量隨細(xì)胞的分裂周期而變化；
　　 (2)Mfn2通過Ras/Raf/MEK/Erk信號傳導(dǎo)通路參與細(xì)