Mfn2對低氧肺動脈平滑肌細胞影響及其機制探討.pdf

1、背景:肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種血管壁細胞過度增殖，最終導(dǎo)致肺細小動脈管腔阻塞的循環(huán)疾病。低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)中最常見類型。HPH的發(fā)生、發(fā)展病理生理主要包括低氧性肺動脈收縮（hypoxic pulmonaryartery

2、 vasoconstriction，HPV）和低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonaryvascular remodeling，HPVR)。我們知道HPVR最重要的病理特征是肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖和肥大，然而其發(fā)生機制目前尚不清楚。線粒體融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）不僅是維持線粒體正常形態(tài)和調(diào)控線粒體融合的重要元素，同時

3、也是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，特別是在細胞增殖、細胞凋亡通路中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Mfn2可以抑制PI3K/Akt信號通路，使線粒體外膜通透性增高，激活線粒體凋亡途徑，細胞色素C大量釋放，激活下游Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells VSCMs)凋亡。Mfn2在心血管疾病中，對VSMCs增殖作用已有較深入研究，但在肺動脈高壓中的研究甚少。我們有理由認為Mfn2既然在心血管

4、疾病VSCMs增殖中發(fā)揮重要的作用，那么其對HPH中PASMCs很可能具有同樣作用。
　　目的:本研究探討Mfn2在HPH模型大鼠肺組織表達情況及其在PASMCs增殖凋亡失衡中發(fā)揮的作用，并進一步研究Mfn2在此過程中對PI3K/Akt信號通路及線粒體凋亡途徑的影響。
　　方法:
　　第一部分:在體動物實驗
　　(1)隨機將20只SD大鼠平均分為常氧組和低氧組，低氧組大鼠每天放在氧濃度為（10±0.5）％的自制有

5、機玻璃箱(0.8m×0.55m×0.40m)中飼養(yǎng)，每天連續(xù)低氧8h，共4周，常氧組在正常氧濃度（氧濃度21％）與低氧組大鼠同等飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng);
　　(2) HPH模型大鼠復(fù)制成功后，通過測量大鼠肺功能、肺動脈平均壓、RVHI（right ventricular hypertrophy index，右心室肥大指數(shù)）鑒定HPH模型;
　　(3)逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR及免疫印跡(Western Blot、wB)技術(shù)檢測正常及HPH模

6、型大鼠Mfn2 mRNA及蛋白表達，WB技術(shù)檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白表達情況。
　　第二部分離體細胞實驗:
　　(1)貼壁法原代培養(yǎng)PASMCs，α-SMA抗體免疫熒光技術(shù)鑒定原代培養(yǎng)的PASMCs;
　　(2)為驗證PASMCs增殖對低氧時間依賴性，本研究選擇不同時間段將PASMCs放在低氧培養(yǎng)箱中進行低氧（氧濃度2.5％）干預(yù)，分別于常

7、氧及低氧條件下培養(yǎng)6h、12h、24h、48h，MTT法檢測細胞增殖，并使用WB技術(shù)檢測低氧0h、6h、12h、24h、48h后PASMCs Mfn2及PCNA蛋白表達情況;
　　(3)經(jīng)以上實驗篩選出PASMCs增殖最佳時間點作為后續(xù)實驗低氧時間，低氧條件下使用LY294002(PI3K抑制劑)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染攜帶pEGFPMfn2質(zhì)粒過表達Mfn2兩種干預(yù)方法進一步驗證Mfn2在此過程中對PI3K/

8、Akt信號通路及線粒體凋亡途徑的影響，通過測定Mfn2蛋白表達檢測轉(zhuǎn)染效率后，再次將實驗分為6組，分別為常氧組、低氧組、低氧+shNC（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）、低氧+shMfn2（轉(zhuǎn)染攜帶Mfn2基因cDNA質(zhì)粒過表達Mfn2組）、低氧+LY294002(PI3K抑制劑)、低氧+LY294002+shMfn2，實驗結(jié)束后，分別使用MTT法和流式細胞術(shù)檢測PASMCs增殖及凋亡情況，以β-actin為內(nèi)參，WB技術(shù)檢測PCNA、Mfn2、p-Ak

9、t、胞漿及線粒體中細胞色素C，cleaved caspase9蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　在體動物研究:低氧組大鼠肺組織Mfn2和蛋白表達較正常組降低，PCNA蛋白表達增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　離體細胞研究:
　　(1) PASMCs從低氧6h開始，MTT法檢測細胞數(shù)量開始增高，并且在24h升高趨勢達到最高，低氧6h、12h、24h、48h與常氧組相比細胞數(shù)量增加且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，12h與24h、

10、48h相比細胞數(shù)量均增加并具有統(tǒng)計學(xué)意義，48h與24h比較增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PASMCs Mfn2 mRNA、蛋白表達從6h開始下降，變化趨勢與MTT法結(jié)果一致。PCNA蛋白表達從6h開始升高，變化趨勢與MTT法結(jié)果一致。
　　(2)轉(zhuǎn)染攜帶pEGFPMfn2的質(zhì)粒過表達Mfn2效率經(jīng)WB技術(shù)檢測Mfn2蛋白表達后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PASMCs轉(zhuǎn)染Mfn2cDNA后，Mfn2蛋白表達與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載組比較表達均升高，差異具有統(tǒng)計

11、學(xué)意義。轉(zhuǎn)染空載組與未轉(zhuǎn)染組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3)上述結(jié)果我們篩選出最佳PASMCs低氧狀態(tài)下增殖時間24h，取改點為低氧觀察時間點。低氧24h組與常氧組相比，Mfn2表達下調(diào)，p-Akt（磷酸化的Akt蛋白）表達增高，激活PI3K/Akt信號通路，使更多進入細胞周期的S+G2/M期，PCNA表達增高，線粒體凋亡通路被抑制，細胞漿與線粒體內(nèi)細胞色素C比值降低，cleaved caspase9蛋白表達下調(diào)，P

12、ASMCs凋亡抑制。
　　(4)單獨過表達Mfn2或單獨使用LY294002干預(yù)后低氧條件下培養(yǎng)24h，與低氧組相比，Mfn2蛋白表達升高，p-Akt表達表達下調(diào)，PI3K/Akt信號通路被抑制，使細胞周期抑制在G0/G1期，PCNA表達下調(diào)，線粒體凋亡通路激活，細胞漿與線粒體內(nèi)細胞色素C比值增高，cleavedcaspase9蛋白表達增高，PASMCs凋亡增加。
　　(5)同時過表達Mfn2及使用LY294002干預(yù)與兩者