內毒素對肺動脈平滑肌細胞收縮能力的影響及機制研究.pdf

1、第一部分內毒素對肺動脈平滑肌細胞收縮能力的影響
　　[目的]敗血癥休克情況下主要表現(xiàn)為體循環(huán)壓力的下降和早期肺循環(huán)壓力的升高，甚至肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)。本實驗旨在探討高濃度的LPS是否導致肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)本身收縮能力的變化?！痉椒ā客ㄟ^急性消化酶分離法獲得單個PASMC，在200倍倒置顯

2、微鏡下，灌流含10μg/ml LPS的生理鹽溶液，通過細胞長度的變化、完成收縮所需時間的變化觀察LPS對PASMC的直接刺激作用。對LPS預處理的PASMC，分別給予80mM高鉀溶液、苯腎上腺素及內皮素-1(endothelin-1，ET-1)，觀察LPS對PASMC的收縮能力的影響?！窘Y果】(1)本實驗采取的急性消化酶法獲得的PASMC存活率>95％，PASMC純度達97.7±1.78％。(2)10μg/ml的LPS不能直接引起PAS

3、MC收縮反應。(3)80mM的高鉀等滲溶液可引起PASMC收縮，經10μg/ml LPS預處理10min，PASMC對80mM高鉀等滲HBSS溶液的反應更敏感，表現(xiàn)為高鉀刺激后2.5min(68.43±1.46 vs47.70±5.70，P<0.001)、5min(75.42±0.87 vs63.45±3.65，P<0.01)、10min(80.23±0.57 vs74.01±2.17，P<0.05)時點收縮幅度較對照組明顯增大。LPS

4、預處理的PASMC完成50％(1.03±0.10 vs2.38±0.36，P<0.01)及90％(4.04±0.31 vs7.14±0.75，P<0.001)總收縮長度所用時間較對照組顯著縮短。(4)10μM及1mM的苯腎上腺素均不能引起PASMC收縮；LPS預處理后，10μM的苯腎上腺素也不能引起PASMC收縮。(5)10nM的ET-1作用于PASMC，約1min左右，PASMC發(fā)生迅速而強烈的收縮。經10μg/ml LPS預處理10

5、min，PASMC對10nM的ET-1的收縮反應沒有明顯的增強或抑制作用(P>0.05)?！窘Y論】10μg/ml的LPS不能直接引起PASMC收縮，經LPS預處理后對80mMK誘發(fā)的收縮反應表現(xiàn)為增敏作用，而對ET-1誘發(fā)的收縮反應無明顯影響。
　　第二部分 LPS對肺動脈平滑肌細胞內鈣離子濃度的影響及其與鈣庫操縱性鈣通道關系
　　[目的]旨在探討LPS對肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth mu

6、scle cell，PASMC)內鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響及其與鈣庫操縱性鈣通道(SOC)的活性和表達的關系。[方法]經典瞬時受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRPC)被證實是SOC的主要分子基礎，通過Real-time PCR檢測正常及LPS刺激后SD大鼠肺動脈平滑肌上TRPC1、3、4、5、6 mRNA的表達。通過鈣離子熒光探針及共聚焦顯微鏡技術觀察LPS對血管收

7、縮劑引起的PASMC細胞內[Ca2+]i變化、鈣釋放(calcium release)和鈣內流(calcium entry)的影響。通過非選擇性SOC阻滯劑SKF-96365、選擇性SOC阻滯劑2-APB、電壓操縱性鈣通道阻滯劑硝苯地平和ET-1的受體阻滯劑BQ-123，觀察SOC引起的鈣內流在PASMC興奮活動中的地位。[結果](1)TRPC1、3、4、5、6在肺動脈、頸動脈和尾動脈上均有表達，相互之間無顯著性差異，P>0.05。10

8、μg/ml LPS孵育10min后，肺動脈上 TRPCI(1.21E-05±0.01E-05 vs3.82E-05±0.46E-05，P<0.001)、TRPC3(1.34E-05±0.17E-05 vs6.29E-05±0.15E-05，P<0.001)、TRPC4(1.36E-05±0.15E-05 vs7.46E-05±0.11E-05，P<0.001)的表達顯著性升高。(2)10μg/mlLPS刺激后，肺動脈上ETA-R(1.3

9、1E-05±0.23E-05 vs5.26E-05±0.15E-05，P<0.01)、ETB-R(1.44E-05±0.10E-05 vs3.43E-05±0.20E-05，P<0.001)的mRNA的表達明顯升高；而α1-腎上腺素受體mRNA的表達顯著降低(3.16E-05±0.10E-05 vs0.72E-05±0.29E-05，P<0.001)。(3)10μg/ml LPS預處理PASMC10min后，細胞內[Ca2+]i無可檢測

10、性變化(0.01±0.01 vs0.01±0.02，P>0.05)，80mM高鉀溶液(0.95±0.06 vs1.25±0.10，P<0.05)及10nM的ET-1(1.56±0.07 vs1.98±0.09，P<0.05)引起的PASMC細胞內[Ca2+]i增幅均較對照組明顯增高。(4)10μg/ml LPS預處理的PASMC鈣釋放較對照組降低(1.36±0.07 vs1.66±0.06，P<0.01)，而鈣內流較對照組增多(1.32

11、±0.10 vs1.06±0.07，p<0.05)。(5)SOC通道依賴的鈣內流在ET-1引起的PASMC激動作用占有重要作用，SOC通道的阻斷劑SKF-96365和2-APB分別可阻斷73.0％和70.8％的PASMC的激活作用。[結論]LPS預處理的PASMC細胞內[Ca2+]i無可檢測性變化，但可使血管收縮劑引起的[Ca2+]i的增幅增大，[Ca2+]i增幅的增大主要來源于鈣內流的增加。LPS可能通過上調SOC(即TRPC)通道的