Fip200siRNA-DNA納米材料調(diào)控肺動脈平滑肌細胞生長及機制研究.pdf

1、肺動脈高壓[1](Pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺血管阻力進行性升高為特征的一組疾病，常伴有右心室的肥厚及擴張，致殘率及病死率高，除了傳統(tǒng)的藥物治療外，基因治療、活體肺移植等新的治療手段逐漸出現(xiàn)，但仍嚴重威脅人類健康。其中缺氧引起的肺動脈高壓，多由慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張等疾病引起。肺血管重構(gòu)[2](Pulmonary vascular remodeling，PVR)學(xué)說認為低氧條件下，

2、肺動脈中存在的肺血管內(nèi)皮細胞及肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的異常增殖及凋亡。自噬作為細胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑，在肺血管重構(gòu)中有重要調(diào)節(jié)作用[3]。目前，肺動脈平滑肌細胞在肺血管重構(gòu)中的自噬的改變尚不十分明確。Fip200作為重要的自噬基因，通過研究Fip200在肺血管重構(gòu)中的作用，有望為PAH的機制研究找到新方向。
　　納米技術(shù)作為新興技術(shù)在醫(yī)學(xué)醫(yī)用

3、領(lǐng)域有寬闊前景，特別是作為運載載體，能高效轉(zhuǎn)運藥物。小RNA作為重要的RNA，能調(diào)控基因的表達，是基因治療的重要方法，但因其運載方式受限，影響其進一步應(yīng)用。將基因治療與納米技術(shù)融合，可改善小RNA的轉(zhuǎn)運問題。DNA納米材料有別于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、病毒、高分子聚合物等傳統(tǒng)的納米材料，可利用DNA雜交原理，實現(xiàn)自組裝，簡單、可控，且本身具有無毒、無免疫源性的特點[4]。核酸適配體是以核酸為基礎(chǔ)，能特意識別細胞的物質(zhì)。因此，設(shè)計轉(zhuǎn)載核酸適配體的自

4、組裝DNA納米材料，為基因治療建立運載平臺。
　　因此，設(shè)計了一種由三種DNA單鏈攜帶Fip200siRNA，通過DNA-RNA雜交技術(shù)，組裝成的新型三角板材料。通過凝膠電泳，驗證其合成效率。通過RT-PCR及Westernblot檢測其對目的基因的干擾作用，研究低氧條件下Fip200在肺血管平滑肌異常增殖及凋亡中的作用，以及低氧條件下Fip200對于TGF-β通路的作用。
　　目的：
　　1.合成一種新型的攜帶siR

5、NA的DNA三角板運載體，檢測其對在PASMCs中的轉(zhuǎn)運效率。
　　2.研究低氧條件下Fip200對PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.探討低氧條件下Fip200影響PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的機制。
　　方法：
　　1.DNA自組裝三角板納米材料的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)運效率的研究。
　　(1)構(gòu)建攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料，通過凝膠電泳檢測其產(chǎn)率，通過激光共聚焦及流式細

6、胞術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　(2)使用RT-PCR及Westernblot檢測攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料對PASMCs細胞中Fip200基因表達的干擾效果。
　　2.培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞，檢測低氧條件下PASMCs增殖凋亡的改變及Fip200siRNA對其影響。
　　(1)使用Westernblot檢測低氧條件下PASMCs增殖、凋亡及自噬的改變。
　　(2)采用流式細胞術(shù)及MTT檢測Fi

7、p200siRNA對低氧條件下PASMCs增殖、凋亡的影響。
　　(3)使用WB檢測Fip200siRNA對PASMCs細胞中TGF-β的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料，并轉(zhuǎn)載了PASMCs的核酸適配體，通過非變性凝膠電泳，驗證其自組裝的效率。
　　2.通過WB及RT-PCR的方法，驗證攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料對于PASMCs中Fip20

8、0的抑制效率，明顯降低了目的基因在mRNA及蛋白水平的表達。
　　3.低氧條件下，PASMCs存在增殖的高表達及凋亡的低表達狀態(tài)，并存在高水平自噬的狀態(tài)。
　　4.攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料轉(zhuǎn)染PASMCs后，有效的抑制了低氧條件下的自噬，并且抑制了細胞的增殖，促進了細胞的凋亡。
　　5.低氧條件下，F(xiàn)ip200siRNA下調(diào)了TGF-β通路，其可能與對細胞增殖及凋亡影響有關(guān)。
　　結(jié)論：<