AGEs調(diào)控RAGE促進(jìn)人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化.pdf

1、 動(dòng)脈硬化、糖尿病血管并發(fā)癥是導(dǎo)致心、腦血管意外的主要原因。高出非糖尿病人群2--4倍,70%的2型糖尿病患者死于心血管疾病【1】。動(dòng)脈粥樣斑塊形成是導(dǎo)致心血管事件最常見的病理改變,但近年對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的研究發(fā)現(xiàn),除動(dòng)脈粥樣斑塊形成這一傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素外,血管鈣化亦是導(dǎo)致糖尿病患者心血管事件發(fā)生的重要因素。最近研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化類似于骨的形成,它是由細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程,同時(shí)存在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變【4】。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)

2、作為動(dòng)脈鈣化的主要細(xì)胞,它的體外誘導(dǎo)鈣化成為心血管疾病發(fā)病機(jī)制的重要研究模型。
最近研究發(fā)現(xiàn)AGEs在糖尿病血管鈣化的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用【5】?，F(xiàn)己證明人血管平滑肌細(xì)胞存在AGEs受體(RAGE)。DM患者體內(nèi)AGEs的代謝增強(qiáng),致使AGEs增多【6】。AGEs與其受體RAGE相互結(jié)合,導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)和氧化應(yīng)激,是誘發(fā)糖尿病血管病變的主要原因之一【7】。糖尿病患者AGEs表達(dá)較正常人升高。AGEs通過與受體RAGE結(jié)合,

3、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)表達(dá),使內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,多種因子表達(dá)發(fā)生變化,從而刺激平滑肌細(xì)胞遷移增殖,加快糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)一步演變【9】。AGEs誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生。
本研究發(fā)現(xiàn) AGEs促進(jìn)人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的鈣化,AGEs處理平滑肌細(xì)胞后其RAGE表達(dá)明顯增高,并呈濃度梯度依賴,同時(shí)OPG的表達(dá)和β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集增強(qiáng),研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)RAGE,OPG,β-catenin表達(dá)水

4、平而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化,進(jìn)一步證實(shí)RAGE在糖尿病動(dòng)脈中膜鈣化中的作用。
第一部分 人股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)
目的：
建立人股動(dòng)脈平滑肌體外培養(yǎng)模型
方法：
運(yùn)用組織塊貼壁法,成功培養(yǎng)出人HSMCs,在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行SM a—actin免疫組化鑒定。
結(jié)果：
細(xì)胞生長(zhǎng)良好,平滑肌細(xì)胞呈典型的“峰谷狀”生長(zhǎng),

5、經(jīng)過免疫熒光發(fā)現(xiàn),細(xì)胞SMα-actin高表達(dá),說明成功培養(yǎng)出平滑肌細(xì)胞。
結(jié)論：
人股動(dòng)脈組織塊貼壁法成功培養(yǎng)出HSMCs,經(jīng)過免疫熒光發(fā)現(xiàn),細(xì)胞SMα-actin高表達(dá),說明成功培養(yǎng)出平滑肌細(xì)胞。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)。
第二部分AGEs調(diào)控平滑肌細(xì)胞鈣化的實(shí)驗(yàn)研究
目的：
探討AGEs促進(jìn)平滑肌細(xì)胞鈣化
方法：
1,檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鈣離

6、子濃度；
2,通過VON KOSSA染色說明AGEs促進(jìn)HSMCs鈣化；
3, 免疫熒光檢測(cè)β-catenin的表達(dá)；
4, western blot檢測(cè)RAGE, β-catenin,OPG,E-cadherin蛋白的表達(dá)情況；
5, RAGEsiRNA干預(yù)后, western blot檢測(cè)RAGE, β-catenin, OPG, E-cadherin蛋白的表達(dá)情況, 并與為干

7、預(yù)之前作比較。
結(jié)果：
1.通過觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài),鈣化+AGES組的鈣化斑塊明顯多于鈣化組。
2. 細(xì)胞VON KOSSA染色結(jié)果表明隨著AGE-BSA濃度的增加,其鈣化表達(dá)的量逐漸升高,同時(shí)鈣化加AGEs(20mg/L)組細(xì)胞數(shù)量明顯多于鈣化組,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核呈現(xiàn)粉紅色的數(shù)量亦增加。
3.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定結(jié)果顯示鈣化+AGEs20 mg/L組的鈣離子濃度明顯升高,其次AG

8、Es40 mg/L組亦升高,這兩組P<0.01,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而鈣化組和AGEs20 mg/L細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度亦明顯升高, P<0.05。
4. β-catenin的表達(dá)隨著AGEs濃度的增加而增強(qiáng),推斷可能由于AGEs的受體RAGE激活了wnt/β-catenin信號(hào)通路,同時(shí)其下游蛋白OPG的表達(dá)亦增強(qiáng).
5. siRNA干擾后, RAGE,β-catenin,OPG的表達(dá)降低。
結(jié)論