西地那非抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺高壓并非一獨(dú)立疾病，而是多種疾病所導(dǎo)致的一種病理生理狀態(tài)，是肺循環(huán)生理生化過程異常的綜合結(jié)果，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高，肺血管阻力增加，最后可導(dǎo)致右心肥厚、右心功能衰竭的臨床綜合征。病理上以無肌細(xì)動(dòng)脈肌化，管壁中層增厚，新生內(nèi)膜形成，管腔狹窄的肺血管重構(gòu)為特征。因此，如何抑制肺高壓中血管重構(gòu)，特別是抑制肺血管中層平滑肌細(xì)胞增殖，已成為肺高壓研究的熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)：磷酸二酯酶 V (PDE-5)抑制劑不僅能抑制平滑肌細(xì)胞的收縮、擴(kuò)

2、張肺血管、降低肺動(dòng)脈壓力，而且還具有抑制肺血管重構(gòu)和平滑肌細(xì)胞增殖甚至復(fù)構(gòu)的作用。本研究利用體外實(shí)驗(yàn)，探討西地那非抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。研究分為3部分： 第一部分：西地那非通過下調(diào)絲裂原激活的蛋白激酶44/42(ERR1/2)磷酸化抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖 目的：通過觀察西地那非對(duì)ERR1/2磷酸化的影響，探討西地那非抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制。 方法：外植塊法培養(yǎng)豬肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，用培養(yǎng)3～

3、5代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為四組：對(duì)照組(C組)；血小板衍生生長(zhǎng)因子刺激組(P組)：細(xì)胞僅給予20ng/ml濃度的PDGF刺激；西地那非干預(yù)組(PS<,1>和PS<,2>組)：先分別給予24、96μmol/l西地那非，20min后再給20ng/ml濃度的PDGF刺激。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)，測(cè)定PDGF干預(yù)3d后細(xì)胞增殖程度，采用5一溴脫氧尿嘧啶(5-Brdu)摻入法，免疫印跡(Western blot)法分別檢測(cè)PDGF干

4、預(yù)24h后細(xì)胞DNA合成水平和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)。Western blot測(cè)定干預(yù)1h后ERR1/2的磷酸化水平。 結(jié)果：P組平滑肌細(xì)胞經(jīng)20ng/ml濃度的PDGF刺激后，其增殖率較對(duì)照組明顯增加，而PS<,1>和PS<,2>組細(xì)胞增殖率相對(duì)P組明顯下降(P<0.05)。5-Brdu摻入也表明，P組增殖細(xì)胞比例達(dá)51％，較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，而PS<,1>和PS<,2>組增殖細(xì)胞比例分別下降到32％

5、，27％，較P組明顯降低(P<0.05)。Western blot顯示PS<,1>和PS<,2>組PCNA的表達(dá)較P組明顯降低。PDGF刺激后，ERR1/2磷酸化水平10min達(dá)高峰，維持1h左右，4小時(shí)后顯著降低。PS<,1>和PS<,2>組1hERR1/2的磷酸化水平較P組明顯降低，而總ERR1/2水平4組差別無顯著性。 結(jié)論：西地那非通過下調(diào)ERR1/2的磷酸化，PCNA蛋白表達(dá)，從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。

6、第二部分：西地那非對(duì)絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)mRNA和蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察西地那非對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1) mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以及cGMP/PKG通路在西地那非誘導(dǎo)。MKP-1蛋白表達(dá)過程中所起的作用。 方法：外植塊法培養(yǎng)豬肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，用培養(yǎng)的3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 1．分別給予0、1．2、24、96、192 μmol/l濃度的西地那非

7、干預(yù)1h。采用RT-PCR和免疫印跡方法分別測(cè)定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 2．細(xì)胞分為四組：對(duì)照組；血小板衍生生長(zhǎng)因子刺激組(P組)：細(xì)胞給予20ng/ml濃度的PDGF刺激；西地那非組(S組)：僅給96μmol/l西地那非刺激；SP組：先給96 μmol/l西地那非，20min后再給20ng/ml PDGF刺激。采用RT-PCR和免疫印跡方法分別測(cè)定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 3．細(xì)胞分為七組：對(duì)照組(C

8、組)；DMSO組(D組)：細(xì)胞給予0.3％DMSO干預(yù)；PKG 阻斷劑組(R組)：給予25μmol/l Rp-8BrcGMP干預(yù)；西地那非組 (S組)：給予96 μmol/l 西地那非干預(yù)；RS組：先給25μmol/l Rp-8BrcGMP，30min后再與96μmol/l西地那非孵育；8-BrcGMP組(G組)：僅給100 μmol/18-BrcGMP干預(yù)；GS組：先給100 μmol/18-BrcGMP干預(yù)，30min后再與96μm

9、ol/l西地那非孵育。七組細(xì)胞干預(yù)1h后檢測(cè)MKP-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：(1)西地那非在0～192 μmol/l濃度范圍不能增加MKP-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄，而在0～96 μmol/l范圍時(shí)，濃度正相關(guān)地促進(jìn)MKP-1蛋白表達(dá)。(2)P組和SP組MKP-1 mRNA水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)， P組、S組、SP組細(xì)胞MKP-1 蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。(3)Rp-8BrcGMP可顯著抑制西地那非引起的M

10、KP-1蛋白上調(diào)，而8-BrcGMP促進(jìn)MKP-1表達(dá)，與C組相比差異有顯著性(P<0.05)。Gs組MKP-1表達(dá)較s組進(jìn)一步升高(P<0.05)。 結(jié)論： (1)在一定濃度范圍內(nèi)(0～96 μmol/l)，西地那非呈濃度依賴性增加。MKP-1蛋白表達(dá)，與mRNA轉(zhuǎn)錄水平無關(guān)。 (2) PDGF刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，能負(fù)反饋引起MKP-1蛋白合成增加，提前給予西地那非干預(yù)能進(jìn)一步促進(jìn)MKP-1蛋白表達(dá)。

11、 (3)西地那非促進(jìn)MKP-1蛋白表達(dá)與cGMP/PKG通路激活有關(guān)。 第三部分：西地那非通過上調(diào)絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討MKP-1蛋白在西地那非抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。 方法：原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。用培養(yǎng)的3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為8組：對(duì)照組(C組)；礬酸鹽組(V組)：給予Vanadatel2.5μmol/l處理；PKG抑制劑組

12、(R組)：細(xì)胞僅給予Rp-8BrcGMP 25μmol/l干預(yù)；血小板衍生生長(zhǎng)因子組(P組)：細(xì)胞只給予20ng/ml PDGF刺激；西地那非干預(yù)組(SP組)：先給予96 μmol/l西地那非，20min后再給予PDGF刺激； VSP組：先給予12．5μmol/l Vanadate，30min后再給西地那非和PDGF干預(yù)；RSP組：先給予25μmol/l Rp-8BrcGMP，30min后再給西地那非和PDGF干預(yù)；8-BrcGMP干預(yù)

13、組(GP組)：先給予100 μmol/18-BrcGMP，20min后再給 PDGF刺激。采用MTT染色法，流式細(xì)胞檢測(cè)(FACS)分別測(cè)定平滑肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期變化，并采用免疫印跡法測(cè)定 ERK1/2的磷酸化水平。 結(jié)果： (1) PDGF (20ng/ml )作用肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后促進(jìn)了ERK1/2的磷酸化，S期細(xì)胞比例明顯上升，3天后細(xì)胞數(shù)目增加表現(xiàn)為OD值較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。 (2) 經(jīng)西

14、地那非干預(yù)后，ERR1/2磷酸化水平、s期細(xì)胞比例較P組降低，OD值下降到0.313，較P組差異有顯著性(P<0.05)。 (3) 分別給予Vanadate和Rp-8BrcGMP預(yù)處理，s期細(xì)胞分別上升到19.1％和14.6％，OD值也分別升高到0.41和0.40，較SP組差異有顯著性(P<0.01)。 (4) 給予8-BrcGMP能顯著抑制PDGF引起的ERK1/2磷酸化上調(diào)，S期細(xì)胞比例和OD值較P組分別抑制57％和