米貝地爾對PDGF誘導(dǎo)增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺動脈高壓（Pulmonary Arterial Hypertension,PAH）是以肺動脈阻力進(jìn)行性增加，肺動脈壓力增高為特征的一組病理生理綜合征。其具體的發(fā)病機(jī)制到目前為止還未完全闡明，但無論何種原因?qū)е碌腜AH，肺血管重構(gòu)都是肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的重要病理特征，其主要病理改變?yōu)榉窝芄鼙谥袑悠交〖?xì)胞的增殖，遷移造成的管壁增厚，無肌細(xì)動脈肌化，新生內(nèi)膜形成，肺血管官腔狹窄、阻塞。因此如何抑制肺高壓中的肺血管重構(gòu)，特別是抑制中層肺動

2、脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移已經(jīng)成為肺高壓治療的重要靶點(diǎn)以及研究的熱點(diǎn)。由于發(fā)生肺高壓時(shí)T型鈣離子通道表達(dá)上調(diào)，而L型鈣通道表達(dá)下調(diào)，所以大部分的肺高壓患者對傳統(tǒng)的鈣通道拮抗劑（阻滯L型鈣通道）并不敏感，普通的鈣拮抗劑也只在急性擴(kuò)血管試驗(yàn)陽性時(shí)才建議使用，而急性擴(kuò)血管實(shí)驗(yàn)陽性的患者只有不足12.8%，研究發(fā)現(xiàn)對于急性擴(kuò)血管實(shí)驗(yàn)陽性的患者長期使用鈣拮抗劑僅有6.8%的患者永久受益。
　　最新的研究發(fā)現(xiàn)新型鈣通道拮抗劑——米貝地爾可以通過

3、作用于T型鈣通道抑制腫瘤患者癌細(xì)胞的增殖而有效地發(fā)揮抗癌效應(yīng)。另有實(shí)驗(yàn)證明其還可以逆轉(zhuǎn)高血壓導(dǎo)致的左室肥厚，使左室重量和重量指數(shù)顯著降低。還有動物實(shí)驗(yàn)研究表明米貝地爾對低氧肺高壓大鼠模型中增殖的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞顯示了很好的抗增殖作用。基于以上研究，我們設(shè)想米貝地爾或可通過抑制PAH發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)的肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖，緩解甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，加上其本身具有的擴(kuò)張血管作用對PAH患者顯示出良好的治療前景。因此本實(shí)驗(yàn)利用體外試驗(yàn)，

4、研究米貝地爾是否具有抑制體外增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞的作用，并探討其可能的作用機(jī)制及其對鈣通道蛋白表達(dá)的影響。研究分為2部分。
　　第一部分：米貝地爾對PDGF誘導(dǎo)增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞的抑制作用及可能的信號通路的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的：以體外培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC）作為研究對象，用血小板衍生生長因子（PDGF）刺激其增殖，研究米貝地爾（Mibefradil）的干預(yù)對PDGF誘導(dǎo)增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞的影響

5、，觀察ERK和Akt磷酸化和總蛋白表達(dá)水平，初步探討米貝地爾抗HPASMC增殖作用的可能信號通路及作用機(jī)制。
　　研究方法：體外培養(yǎng)HPASMCs，用PDGF刺激其增殖，并在米貝地爾干預(yù)，西地那非作為陽性對照干預(yù)條件下，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)分別測定48h和72h各組HPASMC增殖率，用免疫印跡法(Western blot)法檢測在加入PDGF作用后10min各組HPASMC的ERK和Akt磷酸化水平及總蛋白表達(dá)水平

6、的變化，探索米貝地爾是否通過ERK和/或Akt信號通路抑制PDGF誘導(dǎo)的HPASMC增殖。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組，各組處理如下：對照組（C組，不加任何藥物）、PDGF刺激組(P組，加入PDGF-BB25ng/mL培養(yǎng)48h和72h)、米貝地爾組(M組，加入mibefradil10μM培養(yǎng)48h和72h)、PDGF+米貝地爾組(P+M組,先加入mibefradil10μM培養(yǎng)10min，再加入PDGF-BB25ng/mL共同培養(yǎng)48h和72h)

7、、PDGF+西地那非組（P+S組,先加入sildenafil100nM培養(yǎng)10min，再加入PDGF-BB25ng/mL共同培養(yǎng)48h和72h）。其中C組作為空白對照，P+S組作為陽性對照組。
　　研究結(jié)果：
　　1. PDGF刺激組HPASMC經(jīng)25ng/mL濃度的PDGF-BB刺激后，其增殖率在48h和72h均較對照組明顯增加（P<0.01），說明PDGF的刺激誘導(dǎo)了HPASMC的增殖；PDGF+米貝地爾組和PDGF+西

8、地那非組的HPASMCs增殖率與PDGF刺激組相比均表現(xiàn)出明顯下降（P<0.01），說明米貝地爾和西地那非一樣都抑制了PDGF誘導(dǎo)的HPASMC增殖；而PDGF+米貝地爾組和PDGF+西地那非組兩者之間相比差異也具有顯著性（48h,P<0.01;72h,P<0.001），說明西地那非對HPASMC增殖的抑制作用較米貝地爾作用更強(qiáng)。各組HPASMC在48h和72h兩個時(shí)間點(diǎn)之間兩兩配對比
　　較t檢驗(yàn)顯示不同時(shí)間點(diǎn)之間HPASMC增

9、殖率差異無顯著性(P>0.05)。
　　2. PDGF刺激后10min用Western blot法檢測各組HPASMC的ERK1/2和Akt總蛋白和磷酸化表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PDGF刺激組的ERK1/2和Akt蛋白磷酸化水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為 P<0.001，P<0.01）；而ERK1/2和Akt總蛋白的表達(dá)無顯著變化（P>0.05）。PDGF+米貝地爾組和PDGF+西地那非組與PDGF刺激組相比ERK1

10、/2和Akt磷酸化水平均無顯著性差異（均P>0.05），說明米貝地爾對PDGF誘導(dǎo)的HPASMC增殖的抑制作用可能不是經(jīng)過常見的ERK和Akt信號通路。
　　結(jié)論：PDGF對體外培養(yǎng)的HPASMC有促進(jìn)增殖的作用，米貝地爾可以抑制PDGF誘導(dǎo)的HPASMC增殖。但米貝地爾的這種抑制HPASMC增殖作用具體的信號調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確，可能并不是經(jīng)過常規(guī)的ERK和Akt信號調(diào)節(jié)通路。有研究表明可能與Stat3/c-jun信號通路的激活有關(guān)

11、。因此對米貝地爾應(yīng)用于治療肺高壓（PAH）的價(jià)值和有效性還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究去探索和闡明。
　　第二部分：米貝地爾對PDGF誘導(dǎo)增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞中鈣通道蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的：通過體外培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC），用血小板衍生生長因子（PDGF）刺激其增殖，研究米貝地爾（Mibefradil）對PDGF誘導(dǎo)增殖的人肺動脈平滑肌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用過程中對肺高壓時(shí)發(fā)生改變的鈣通道蛋白 TRPC1、T

12、RPC3、TRPC6、Cav1.2，Cav3.2五種相關(guān)的鈣通道蛋白表達(dá)的影響。探討米貝地爾對肺高壓血管重構(gòu)抑制作用的可能作用機(jī)制。
　　研究方法：以體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞為研究對象，取對數(shù)生長期HPASMCs隨機(jī)分為4組：對照組（C，不加任何處理）、PDGF刺激組(P，PDGF-BB25ng/mL)、米貝地爾組(M，PDGF-BB25ng/mL+mibefradil10μM)、西地那非組（S，PDGF-BB25ng/mL+

13、 sildenafil100nM）。其中C組作為空白對照，S組作為陽性對照。用免疫印跡法（Western blot）測定經(jīng)PDGF-BB干預(yù)72后各組HPASMCs的鈣通道蛋白TRPC1/3/6，Cav1.2，Cav3.2的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　各處理組HPASMCs,除了PDGF刺激組的TRPC6蛋白表達(dá)量與對照組比較表達(dá)增加，且差異具有顯著性（P=0.009）外，TRPC1，TRPC3，Cav1.2和Cav3.

14、2四種鈣通道蛋白表達(dá)水平均無顯著差異（P>0.05），而經(jīng)PDGF刺激后的HPASMC在米貝地爾和西地那非的干預(yù)作用下（即PDGF+米貝地爾組和PDGF+西地那非組），TRPC1和Cav1.2鈣通道蛋白表達(dá)水平與PDGF組相比均表達(dá)上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.086，P=0.100）。
　　結(jié)論：米貝地爾抑制 HPASMC增殖的作用并不通過調(diào)節(jié) TRPC1，TRPC3，TRPC6，Cav1.2和Cav3.2等PAH時(shí)表