葛根異黃酮抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 動(dòng)脈粥樣硬化和經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)后(percutaneous transluminal coronary angioplast,PTCA)再狹窄與平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過(guò)度增殖有關(guān).葛根異黃酮是自豆科植物野葛干燥根的提取物的成分,主要有效成分為4,7-二羥基8-β-D葡萄糖異黃酮(葛根素)和4,7-二羥基異黃酮(大豆苷元).葛根素可以抑制兔主動(dòng)脈SMC增生,促進(jìn)其凋亡;大豆苷

2、元能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增生,抑制SHRSP大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增生及DNA的合成.該課題意圖通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)葛根素和大豆苷元抑制人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human umbilical Arterial smooth muscle cell,HUASMC)增殖的藥效并從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)等角度探討其機(jī)制,為葛根素和大豆苷元預(yù)防此類(lèi)疾病提供理論依據(jù).方法 1.葛根素和大豆苷元對(duì)HUASMC增殖的抑制作用:體外培養(yǎng)HUASMC,設(shè)立空白

3、對(duì)照組及不同濃度葛根素和大豆苷元組,MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)檢測(cè)細(xì)胞倍增狀態(tài),確定最佳藥物作用濃度及時(shí)間.2.差異篩選葛根素和大豆苷元抑制HUASMC增殖的相關(guān)基因:體外培養(yǎng)細(xì)胞,給予葛根素和大豆苷元刺激,提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行DD-PCR反應(yīng),篩選差異片斷.3.克隆差異片斷:擴(kuò)增差異片斷并純化,通過(guò)T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pGEMT載體相連,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌JM109,篩選并鑒定陽(yáng)性重組子,測(cè)序并Genbank檢索.選擇

4、奢侈基因進(jìn)一步研究.4.目的基因在HUASMC中表達(dá)的鑒定:培養(yǎng)HUASMC并給予葛根素和大豆苷元刺激,提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性反轉(zhuǎn)錄PCR.5.蛋白表達(dá)及純化:根據(jù)差異基因編碼序列設(shè)計(jì)引物,以全長(zhǎng)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,與pET32a載體連接,轉(zhuǎn)化入Origami(DE3),0.25mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),使用Ni-NTA His Band Resins純化蛋白,腸激酶酶切融合蛋白,12％SDS-PAGE電泳,考馬斯亮蘭