腺病毒介導(dǎo)的人eNOS基因轉(zhuǎn)染抑制血管平滑肌細胞增殖及其機制的研究.pdf

1、第一部分 人eNOS基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的：利用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因(heNOS)和．-半乳糖苷酶基因(LacZ)重組腺病毒并在293細胞中擴增制備重組病毒 方法：利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增出heNOS全長基因，插入PSUCMV中構(gòu)建成腺病毒穿梭質(zhì)粒PSUCMV-heNOS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5．，挑取陽性菌株，酶切鑒定正確后，DNA測序，結(jié)果與基因數(shù)據(jù)庫中人內(nèi)皮型

2、一氧化氮合成酶cDNA序列一致；與5型腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3共轉(zhuǎn)染293細胞包裝病毒顆粒，得到含有攜帶heNOS的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(AdCMV-heNOS)的病毒上清，純化病毒，用TCID50方法測病毒滴度。 結(jié)果：成功構(gòu)建人eNOS重組腺病毒載體和LacZ重組腺病毒載體，病毒滴度達3.5X10<'10> PFU/ml和3.0X10<'10>PFU/ml，通過PCR鑒定正確。 結(jié)論：heNOS重組腺病毒的構(gòu)建

3、為血管內(nèi)膜增生等疾病的基因治療提供可能。 第二部分 腺病毒介導(dǎo)的人eNOS基因轉(zhuǎn)染抑制血管平滑肌細胞增殖及其機制的研究 目的：觀察腺病毒介導(dǎo)的人eNOS基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞增殖的作用，探討人eNOS基因轉(zhuǎn)染對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI)p21、p27表達的變化及細胞周期、凋亡的影響。 方法：原代培養(yǎng)人臍帶動脈平滑肌細胞并純化鑒定，以不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)的heNOS重組腺病毒轉(zhuǎn)染血管

4、平滑肌細胞，噻唑藍比色法測定吸光度值(OD570)，繪制細胞生長曲線。同時LacZ重組腺病毒轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細胞為對照組。NADPH染色、細胞免疫組化、RT-PCR、western blot檢測血管平滑滑肌細胞中的人eNOS基因的表達。放射免疫法檢測血管平滑肌細胞中的cGMP的表達變化；western blot檢測血管平滑肌細胞中p21、p27蛋白的變化，流式細胞術(shù)分析對細胞周期分布及凋亡的影響。 結(jié)果：隨著MOI值的增

5、大，吸光度值逐漸降低，轉(zhuǎn)染120h以后MIO為300組與MOI為100、150、200組及空白對照組比較顯著抑制血管平滑肌細胞的增殖(p<0.01)。以MOI為300轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞48h，NADPH染色、細胞免疫組化、RT-PCR、western blot均證實有人eNOS基因的表達，對照組無表達。放射免疫法檢測heNOS轉(zhuǎn)染組cGMP含量明顯高于LacZ組和未轉(zhuǎn)染組，有顯著差異(p<0.01)。western blot證實heNO

6、S轉(zhuǎn)染組的p21、p27蛋白表達明顯上調(diào)(0<0.05)。細胞流式檢測heNOS轉(zhuǎn)染組G0/G1期細胞平均百分數(shù)與對照組比較明增加(0<0.05)。轉(zhuǎn)染24h和72h后三組無明顯細胞凋亡(p>0.05)。 結(jié)論：人eNOS基因轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞抑制細胞增殖，通過p21、p27上調(diào)導(dǎo)致細胞周期的阻滯，無誘導(dǎo)細胞凋亡。 第三部分 腺病毒介導(dǎo)的人eNOS基因轉(zhuǎn)染抑制大鼠頸動脈損傷后新內(nèi)膜形成 目的：探討腺病毒介導(dǎo)的人e

7、NOS基因局部轉(zhuǎn)染對大鼠頸動脈損傷后新生內(nèi)膜的影響。 方法：SD大鼠球囊損傷頸動脈后，分別局部轉(zhuǎn)染滴度為3.0×x10<'10> pfu/mlLacZ重組腺病毒(n=8)和3.5×10<'10>pfu/ml heNOS重組腺病毒(n=8)100ul，轉(zhuǎn)染30分鐘，同時設(shè)單純損傷為對照組。于4、7、14、21天后切取損傷動脈，免疫組化法、western blot檢測轉(zhuǎn)染損傷動脈壁中層heNOS的表達。蘇木精-伊紅染色觀察損傷動脈的

8、內(nèi)膜和中膜的增生情況，單盲法計算機分析內(nèi)膜和中膜的面積及其比值，判斷內(nèi)膜增生程度。 結(jié)果：成功建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，免疫組化、western blot證實heNOS基因在轉(zhuǎn)染損傷的動脈壁中層有效的表達。頸動脈損傷7天后內(nèi)膜開始增生，14天后進一步加重，血管平滑肌細胞遷移和增殖，基質(zhì)細胞增多，21天后內(nèi)膜增生嚴重，管腔狹窄明顯而heNOS轉(zhuǎn)染內(nèi)膜增生不明顯。形態(tài)學(xué)分析顯示損傷14、21天后heNOS組內(nèi)膜面積、內(nèi)膜面積/中膜