eNOS基因轉(zhuǎn)染抑制血管損傷后平滑肌細(xì)胞增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、基因治療是將一個(gè)有治療作用的基因片段,通過(guò)各種載體介導(dǎo),轉(zhuǎn)移至作用部位,使其在局部發(fā)揮作用,從而避免了對(duì)全身產(chǎn)生副作用.該實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建含有目的基因eNOS cDNA的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(pcDNA3.1-eNOS),轉(zhuǎn)染血管損傷后大鼠頸總動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,觀(guān)察其對(duì)損傷后血管平滑肌細(xì)胞增生的抑制作用.第一部分真核表達(dá)載體pcDNA3.1-內(nèi)皮型一氧化氮(pcDNA3.1-eNOS)的構(gòu)建方法:利用限制性?xún)?nèi)切

2、酶EcoR Ⅰ將原核載體pUC13-eNOS酶切并提取其中的eNOS cDNA,與真核載體pcDNA3.1(-)通過(guò)EcoR Ⅰ相連接,構(gòu)建成pcDNA3.1-eNOS真核表達(dá)載體,并經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切及PCR技術(shù)鑒定重組載體是否含有目的基因eNOS cDNA.第二部分大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄模型的建立及血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法:(1)制備Wastar大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄模型,經(jīng)組織病理切片進(jìn)行HE和Verhoeff

3、鐵蘇木精染色觀(guān)察血管再狹窄程度;(2)進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng),應(yīng)用抗平滑肌細(xì)胞的α-actin抗體鑒定平滑肌細(xì)胞.第三部分eNOS基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞增殖規(guī)律的影響及對(duì)血管再狹窄程度的影響方法:(1)以Fugene 6作為載體將pcDNA3.1-eNOS基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的Wastar大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后的血管平滑肌細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR、原位雜交及免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pcDNA3.1-eNOS基因和eN