心腦寧誘導(dǎo)增生血管平滑肌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究目的:探討以活血化瘀為主的中藥復(fù)方心腦寧體外誘導(dǎo)增生血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制.研究方法:1.血管平滑肌細(xì)胞增生模型的建立1.1血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng):貼塊法1.2血管平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng):第四代1.3 IL-1刺激血管平滑肌細(xì)胞建立增生模型:2.中藥藥液的制備2.1中藥組成黃芪15g、枸杞10g、葛根10g、丹參10g、川芎5g、茯苓10g、半夏10g、、杜仲10g、水蛭10g、枳殼10g2.2制備方法分別用100μm、4

2、μm濾器,濾除中藥煎劑藥液中的粗顆粒沉淀和極細(xì)顆粒沉淀及細(xì)菌,配成實(shí)驗(yàn)所需20g/100ml中藥液,再添加雙蒸水配成濃度為10g/100ml、5g/100ml的不同濃度藥液.3.中藥干預(yù)平滑肌細(xì)胞增生模型3.1干預(yù)方法:傳至第四代在培養(yǎng)液中加入中藥藥液3.2干預(yù)濃度:用20％、10％、5％三種濃度,3.3干預(yù)時(shí)間:分為48min、12h、24h三組,3.4同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組平行對(duì)照.4.凋亡細(xì)胞的檢測(cè)4.1瓊脂糖凝膠電泳法:細(xì)胞凋亡時(shí)其

3、染色質(zhì)DNA在核小體連接處斷裂,形成180-200bp或其整倍數(shù)的寡核苷酸,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯狀條帶(DNA Ladder).4.2流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡時(shí),G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰(subG<,1>).4.3透射電子顯微鏡觀察可見到凋亡細(xì)胞的不同形態(tài)學(xué)改變.研究成果:20％、10％、兩種濃度在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均誘導(dǎo)凋亡出現(xiàn),5％濃度只在24h出現(xiàn)凋亡.研究結(jié)論:活血化瘀中藥復(fù)方心腦寧可以在體外誘導(dǎo)增生血管平滑肌細(xì)胞凋亡,這對(duì)中醫(yī)藥治療動(dòng)脈粥