皂苷C抑制血管緊張素Ⅱ促血管平滑肌細胞增殖作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 高血壓病及其并發(fā)癥是心血管疾病的主要死亡原因之一，血管重塑在其中扮演了關(guān)鍵角色。血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecell，VSMC)增殖是血管重塑發(fā)生發(fā)展的主要病理生理過程之一。研究證實血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的VSMC增殖在高血壓血管重構(gòu)過程中起著重要作用，可通過升高還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide-adenine dinucleotide ph

2、osphate，NADPH)氧化酶活性，促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，然后通過ROS/絲裂原活化蛋白激酶(mitoten-activated protein kinase，MAPK)通路介導(dǎo)VSMC增殖。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinases1/2，ERK1/2)是最經(jīng)典的MAPK通路，生長因子、細胞因子刺激VSMC增殖的效應(yīng)主要是

3、由ERK1/2介導(dǎo)，ERK1/2磷酸化激活后，進一步誘導(dǎo)下游靶點如核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、c-myc活化，從而促進VSMC增殖。
　　 皂苷C(reinioside C，RC)是從傳統(tǒng)中藥黃花倒水蓮(Polygalafallax Hemsl)中提取的主要活性成分之一。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃花倒水蓮具有抗應(yīng)激、抗病毒、調(diào)血脂

4、、活血、抗炎、抗衰老和抗脂質(zhì)過氧化等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)皂苷C能夠抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的單核-內(nèi)皮細胞粘附，其機制可能與其抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。本課題擬在培養(yǎng)的VSMC，觀察皂苷C對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖的作用，并探討其可能機制。
　　 方法：
　　 (1)不同濃度的皂苷C(3、10、30μM)、ROS特異性抑制劑DPI(10μM)預(yù)處理VSMC1 h后，再加入10-6M AngⅡ處理VSMC24 h，BrdU標記法分

5、析細胞DNA合成能力，流式細胞儀檢測細胞周期評估細胞增殖水平。
　　 (2)不同濃度的皂苷C(3、10、30μM)、DPI(10μM)預(yù)處理VSMC1 h后，再加入10-6M AngⅡ處理VSMC24 h，Real-time PCR檢測細胞內(nèi)NADPH氧化酶亞基：p22phox、gp91phox mRNA的表達，DCFH-DA熒光法檢測細胞內(nèi)ROS水平。
　　 (3)不同濃度的皂苷C(3、10、30μM)、DPI(10μ

6、M)、ERK1/2特異性抑制劑PD98059(40μM)預(yù)處理VSMC1 h后，再加入10-6MAngⅡ處理VSMC2 h，Western Blot法檢測磷酸化ERK1/2的表達。
　　 (4)不同濃度的皂苷C(3、10、30μM)、NF-κB特異性抑制劑PDTC(10μM)、PD98059(40μM)預(yù)處理VSMC1 h后，再加入10-6M AngⅡ處理VSMC24 h，收集漿蛋白后，采用Western blot法檢測IκB-

7、α蛋白表達；收集核蛋白后，采用凝膠遷移實驗測定NF-κB活性。
　　 (5)不同濃度的皂苷C(3、10、30μM)、DPI(10μM)、PD98059(40μM)預(yù)處理VSMC1 h后，再入10-6M AngⅡ處理VSMC24 h，Real-time PCR測定AP-1亞基：c-fos和c-jun，原癌基因：c-mycmRNA的表達。
　　 結(jié)果：
　　 (1)AngⅡ(10-6M)處理24 h顯著刺激VSMC增

8、殖，皂苷C(3，10，30μM)可濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的促增殖效應(yīng)，ROS特異性抑制劑DPI(10μM)可明顯抑制AngⅡ所致的上述作用，單獨應(yīng)用皂苷C(30μM)對VSMC增殖無影響。
　　 (2)AngⅡ(10-6M)處理2 h顯著增加VSMC中NADPH氧化酶亞基：p22phox、gp91phox mRNA表達和ROS生成，皂苷C(3，10，30μM)可濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p22phox、gp91phox

9、 mRNA表達和ROS生成，DPI(10μM)可明顯抑制AngⅡ上述作用，單獨應(yīng)用皂苷C(30μM)對NADPH氧化酶和ROS生成無影響。
　　 (3)AngⅡ(10-6M)處理2 h顯著促進ERK1/2磷酸化，皂苷C(3，10，30μM)可濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，DPI(10μM)和ERK1/2特異性抑制劑PD98059(40μM)可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，單獨應(yīng)用皂苷C(30μM)

10、對ERK1/2磷酸化無影響。
　　 (4)AngⅡ(10-6M)處理24 h顯著增強VSMC中NF-κB活性，上調(diào)c-fos、c-jun、c-myc mRNA的表達，皂苷C(3，10，30μM)可濃度依賴性地降低AngⅡ誘導(dǎo)的NF-κB活性，抑制AP-1和c-mvc表達，NF-κB特異性抑制劑PDTC(10μM)和ERK1/2特異性抑制劑PD98059(40μM)可顯著抑制AngⅡ所致的上述作用，單獨應(yīng)用皂苷C(30μM)對NF