姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、目的：近年來(lái)伴隨生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病率逐年上升，已成為引發(fā)心腦血管疾病如心肌梗死、腦血管病和周?chē)懿」餐牟±砘A(chǔ)，也是引起發(fā)病率和死亡率增高的常見(jiàn)原因。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是構(gòu)成血管壁的重要組成成分，在AS的整個(gè)病理變化中都起了作用。因此探討調(diào)節(jié)VSMCs生理病理功能，對(duì)防治AS具有重要意義。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的主要肽類(lèi)激素，可誘導(dǎo)VSMCs的增殖及遷移

2、，目前已成為誘導(dǎo)各種心血管疾病病理基礎(chǔ)的主要刺激因素之一。由此可見(jiàn)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs過(guò)度增殖可作為一個(gè)治療AS的重要靶點(diǎn)。研究表明，氧化應(yīng)激（OS）是AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要促進(jìn)因素之一。OS是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，組織內(nèi)部活性氧族（ROS）和活性氮自由基（RNS）的生成速率大于清除速率導(dǎo)致體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡進(jìn)而發(fā)生一系列氧化應(yīng)激損傷。ROS是機(jī)體正常代謝所必需的，當(dāng) ROS的生成大于清除時(shí)，過(guò)多的ROS堆積會(huì)直接損

3、害細(xì)胞功能，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能并誘導(dǎo)VSMCs遷移、增殖和基質(zhì)成分過(guò)表達(dá)加重AS病變進(jìn)展；RNS主要包括一氧化氮（NO）、過(guò)氧化亞硝酸鹽（ONOO-）等。生物體內(nèi)本身具有許多抗氧化防御劑，目前已證實(shí)至少有三大抗氧化酶家族主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Gpx）和過(guò)氧化氫酶（CAT），其主要用于保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。因此，抗氧化藥物在治療AS中起著重要作用。姜黃素（Cur）是從姜科草本植物姜黃根莖中提取的一種天

4、然多酚類(lèi)物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用。姜黃的研究歷史悠久，其味辛、苦、性溫，入肝脾二經(jīng)，是一味常用的中藥，而 Cur作為姜黃的主要活性成分，發(fā)現(xiàn)具有抗增殖、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、降血脂、抗癌等多種藥理學(xué)作用，且具有顯著的心血管保護(hù)活性。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示：Cur的攝入量與AS的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以期為Cur抗AS的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以大鼠主動(dòng)脈分離后原代培養(yǎng)的

5、VSMC為研究對(duì)象，在AngⅡ刺激誘導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，如噻唑藍(lán)（MTT法）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，RT-PCR）、蛋白印跡法（Western blot）等，觀察Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖及氧化應(yīng)激的影響以期為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠VSMCs細(xì)胞，MTT法測(cè)定不同濃度Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖

6、的影響。并分別設(shè)對(duì)照組、AngⅡ干預(yù)組、20μmol/L Cur組及AngⅡ聯(lián)用不同濃度Cur（5、10、20μmol/L）組，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot測(cè)定各組細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、p47phox mRNA與蛋白的表達(dá)。亞硝酸鹽含量重氮化反應(yīng)吸光測(cè)定法（Greiss assay）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）的表達(dá)。DCFH-DA氧化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各試驗(yàn)組細(xì)胞上清液中SOD活性，采用

7、分光光度計(jì)測(cè)定Gpx活性。采用p47phox特異性siRNA干擾VSMCs p47phox的表達(dá)，并深入探討Cur抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴給予10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs72h，VSMCs增殖增強(qiáng)，相比給予不同濃度的Cur預(yù)處理1 h，可觀察到細(xì)胞增殖受到抑制且表現(xiàn)出劑量依賴性。⑵RT-PCR與Western blot檢測(cè)分析VSMCs iNOS和p47phox mRNA及蛋白

8、表達(dá)：給予VSMCs10-7mol/L AngⅡ刺激3 h，iNOS和p47phoxmRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；使用不同濃度Cur預(yù)處理1 h，再給予同濃度AngⅡ刺激3 h，iNOS和p47phox mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào)并隨著Cur濃度的增加其iNOS和p47phox mRNA及蛋白表達(dá)水平呈逐漸下降的趨勢(shì)（P<0.05）。⑶Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)以及SOD、Gpx活性的影響：給予VSM

9、Cs10-7mol/L AngⅡ刺激24h后，VSMCs細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，SOD及Gpx活性明顯降低；給予不同濃度Cur預(yù)處理1h，能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞內(nèi)ROS合成，并且發(fā)現(xiàn)SOD及Gpx活性升高，且呈濃度依賴性（P<0.05）。⑷本實(shí)驗(yàn)已證明，Cur能夠濃度依賴性下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)p47phox蛋白和mRNA的表達(dá)（P<0.05）。進(jìn)一步用p47phox特異性siRNA下調(diào)p47phox表達(dá)，結(jié)果顯示

10、，伴隨p47phox的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，VSMCs細(xì)胞內(nèi)ROS生成亦減少。證明，Cur可通過(guò)下調(diào)p47phox表達(dá)抑制ROS的產(chǎn)生從而發(fā)揮其抗氧化作用。
　　結(jié)論：①Cur能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs的增殖，且這種抑制作用呈濃度依賴性。②Cur可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs iNOS基因表達(dá)及NO產(chǎn)量，并呈濃度依賴性；Cur濃度越高，iNOS基因表達(dá)及NO產(chǎn)量越低。③Cur可逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)SOD、