血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖毎幸职┗騊TEN的影響及分子機制研究.pdf

1、血管平滑肌細胞(vascular smoooth muscle cell，VSMC)位于動脈血管中膜，是血管中層唯一的細胞成分。VSMC的異常增殖，導(dǎo)致其由中膜遷移到內(nèi)膜下間隙，是冠狀動脈硬化、經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)再狹窄以及高血壓血管肥厚等疾病的病理基礎(chǔ)。因此找到VSMC異常增殖的機制，抑制VSMC異常增殖是治療這些血管肥厚性疾病的重要途徑。
　　 人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase

2、and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，是具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟、胃腸道、肺臟及皮膚等全身多器官均有表達，且參與多種生理過程，尤其是對腫瘤細胞的生長、增殖、分化、凋亡、粘附和遷移均具有重要影響。近年來，對PTEN的研究逐漸從腫瘤領(lǐng)域延伸到其他領(lǐng)域中，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)PTEN在心肌肥大，高血壓，動

3、脈粥樣硬化，支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。本課題應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖和遷移，從細胞和分子水平深入探討AngⅡ是否影響平滑肌細胞中抑癌基因PTEN的活性和表達以及其下游信號通路，發(fā)揮促血管平滑肌細胞異常增生和遷移的作用。并且初步探討血管平滑肌細胞增殖中PTEN的表達如何被調(diào)控。
　　 一、血管緊張素Ⅱ促進平滑肌細胞增殖和遷移，抑制凋亡
　　 應(yīng)用MTT法，CC

4、K-8法及劃痕實驗，證實AngⅡ可以促進平滑肌細胞的增殖與遷移，并且確定了AngⅡ的最佳濃度和作用時間。經(jīng)MTT法檢測細胞活力，發(fā)現(xiàn)1μmol/L以及10μmol/L兩個濃度的AngⅡ作用12小時和24小時后均能顯著促進平滑肌細胞增殖，而0.1μmol/L AngⅡ作用不及另兩個濃度。1μmol/L AngⅡ增殖促進率為12小時13.6％(p＜0.001)，24小時13.9(p＜0.01)，作用穩(wěn)定。再經(jīng)CCK-8法確證1μmol/L的

5、AngⅡ在24小時內(nèi)呈時間依賴性的促進平滑肌細胞增殖，12小時和24小時對平滑肌細胞增殖的促進率分別為10.4％(p＜0.01)和9.8％(p＜0.05)。劃痕實驗的結(jié)果顯示，1μmol/L的AngⅡ在12小時內(nèi)呈時間依賴性的促進平滑肌細胞遷移，12小時后AngⅡ組平滑肌細胞遷移的距離約為正常組的1.7倍(p＜0.05)。在檢測AngⅡ影響細胞活力的同時，應(yīng)用免疫印記法檢測了細胞中caspase-3的表達，來反映細胞凋亡水平。結(jié)果顯示，

6、12小時內(nèi)1μmol/L的AngⅡ可使平滑肌細胞中Caspase-3蛋白的表達呈時間依賴性的減少，降低細胞的凋亡水平。
　　 二、血管緊張素Ⅱ?qū)ζ交〖毎蠵TEN及其通路的影響
　　 實驗應(yīng)用western blot檢測法及非還原電泳法檢測AngⅡ刺激細胞后，PTEN，phospho-PTEN(p-PTEN),reduced-PTEN(re-PTEN),oxidized-PTEN(ox-PTEN)及PTEN下游通路蛋白

7、phospho-Akt(p-Akt)和phospho-FAK(p-FAK)表達的變化。同時應(yīng)用Realtime-PCR法檢測PTENmRNA水平的變化。此外，應(yīng)用還原型二氯熒光素(2′，7′-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的變化，考察自由基水平與re-PTEN和ox-PTEN表達的關(guān)系。結(jié)果顯示，0.1μmol/L

8、，1μmol/L以及10μmol/L的AngⅡ分別作用于血管平滑肌細胞24h時，細胞內(nèi)PTEN蛋白的表達水平呈濃度依賴性降低。選用1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌細胞0-12h，PTEN的表達呈現(xiàn)時間依賴性的降低，12h時，其表達降低至正常對照組的1/4(p＜0.001)。RT-PCR的檢測結(jié)果顯示1μmol/L AngⅡ刺激細胞2h后PTENmRNA水平已降低至對照組的1/2(p＜0.01)。說明AngⅡ可以從基因和蛋白水平降低P

9、TEN的轉(zhuǎn)錄和表達。應(yīng)用western blot方法檢測到，AngⅡ刺激平滑肌細胞5min后可快速卻短暫的升高p-PTEN的表達，2小時后趨于正常水平。向細胞內(nèi)載入DCFH熒光探針，用AngⅡ刺激后不同時間檢測到的細胞內(nèi)熒光強度反映細胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果顯示，AngⅡ刺激平滑肌細胞可以快速升高細胞內(nèi)活性氧的水平，1小時后達到對照組的1.5倍(p＜0.01)，持續(xù)升高2小時后逐漸降低，12小時后基本恢復(fù)正常氧化還原狀態(tài)。這與1μmol/L

10、的AngⅡ作用于平滑肌細胞2h，應(yīng)用非還原電泳檢測到的ox-PTEN的表達逐漸升高的結(jié)果具有一致性。1μmol/L的AngⅡ使平滑肌細胞內(nèi)受PTEN負調(diào)控的Akt及FAK通路被激活，p-Akt及p-FAK的表達均呈時間依賴性的升高，AngⅡ作用12小時后p-Akt的表達升高至正常對照組的4.5倍(p＜0.001);p-FAK的表達升高至正常對照組的3.5倍(p＜0.001)。
　　 三、血管緊張素Ⅱ影響平滑肌細胞內(nèi)PTEN表達的

11、機制研究
　　 預(yù)先用某些信號通路或因子的抑制劑、激動劑對平滑肌細胞進行預(yù)處理1小時，再加入1μmol/L的AngⅡ共同作用12小時，應(yīng)用western blot和CCK-8法考察各種調(diào)節(jié)劑對細胞內(nèi)PTEN表達水平的影響及對平滑肌細胞增殖的影響，以此分析AngⅡ影響PTEN表達水平的調(diào)控機制。western blot檢測結(jié)果顯示，AngⅡ受體抑制劑洛沙坦(losartan，Losa)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxis

12、ome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)激動劑羅格列酮(rosiglitazone，Rosi)及細胞核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抑制劑BAY11-7082可以使PTEN的表達恢復(fù)甚至高于正常組PTEN的表達；c-jun氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase，JNK)抑制劑SP600125組PTEN的表達較AngⅡ組也略有提高；抗氧

13、化劑α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)組細胞PTEN的表達與AngⅡ組相比無明顯變化；而磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002，促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK kinase1/2 or ERK kinase1/2, MEK1/2)抑制劑UO126及p38 MAPK抑制劑SB203580三組細胞PTEN的表達較AngⅡ組有不同程度的減少。細胞經(jīng)相同的處

14、理后，應(yīng)用CCK-8法檢測各種調(diào)節(jié)劑均對細胞的生長具有抑制作用。NF-κB抑制劑對細胞的生長抑制作用最為明顯，抑制率達50％;PI3K抑制劑，JNK抑制劑及p38MAPK抑制劑對細胞生長的抑制率在20％左右；洛沙坦，羅格列酮及MEK1/2抑制劑對細胞生長的抑制率在10％左右；而α-硫辛酸(α-LA)對細胞生長的抑制率為4.23％，不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 本課題用AngⅡ作為誘因，證實在血管平滑肌細胞過度增殖和遷移的病理過程中抑