血管緊張素Ⅱ和血管緊張素-(1-7)對人氣道平滑肌細胞收縮的調控機制.pdf

1、一、研究背景
　　 支氣管哮喘(bronchial asthma)是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，這種慢性炎癥常導致氣道反應性的增高。氣道平滑肌收縮帶來的氣流受限可引起的廣泛而多變的氣流阻塞而目前研究認為，哮喘病人的氣道重塑是最終導致氣流受限的關鍵因素。哮喘氣道重塑主要是是以氣道平滑肌增生肥大，粘膜組織化生，炎癥細胞浸潤，肌纖維母細胞增生，氣道水腫和新生血管形成為特征，這也是氣道高反應性的關鍵因素。氣道重塑會造成

2、氣道對氣管擴張劑及激素反應性下降，從而造成哮喘晚期氣流受限不完全可逆。刺激哮喘氣道平滑肌細胞收縮因素多種多樣，主要包括變應原刺激、細菌病毒感染等對體內炎癥細胞趨化、各種細胞因子釋放及體內腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活等。哮喘作為一種慢性疾病，怎樣才能針對以上環(huán)節(jié)減少氣道重塑狀態(tài)下的氣流受限是目前迫切需要解決的問題。
　　 既往對RAS的研究多集中于心血管、腎臟、肝臟系統(tǒng)，證實其對細胞增殖、纖維化、炎癥等方面有著重要作用。肺臟

3、同樣存在RAS系統(tǒng)組分及其受體，近來研究發(fā)現血管緊張素Ⅱ l型受體(AT-1R)在肺臟的高表達及ACE基因的多態(tài)性和哮喘發(fā)作有著重要關聯，有研究證實哮喘病人的AngⅡ水平是升高的。RAS對氣道收縮的作用越來越多的收到人們的關注，其新組分血管緊張素轉換酶2(ACE2)-血管緊張素-(1-7)(Ang-(1-7))- MAS軸的發(fā)現為疾病的治療提供新的方向。ACE2與ACE雖同屬一族但功能迥然不同。ACE是肽酰二肽酶，有兩個催化區(qū)，而ACE

4、2是羧肽酶，只有一個催化區(qū)，因此它們的底物不同。ACE2將AngⅠ和AngⅡ的C端裂解分別產生Ang-(1-9)和Ang-(1-7); Ang-(1-9)可由ACE裂解為Ang-(1-7)。因為ACE2裂解產生的Ang-(1-7)要多數百倍，因此ACE2是產生Ang-(1-7)的關鍵酶。Mas受體又是Ang-(1-7)主要作用受體。目前研究證實ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸是ACE-AngⅡ-AT-1R受體軸內在調節(jié)途徑，有

5、望成為哮喘治療的新的靶點。目前國內外研究認為，在心血管、腎臟、肝臟等器官，Ang-(1-7)可拮抗AngⅡ作用，具有抗增殖、抗炎、抗纖維化的作用。目前在血管平滑肌方面研究顯示AngⅡ通過激活RhoA，從而引發(fā)細胞收縮;AngⅡ還可以通過Rho/ROCK信號通路對腎臟足突細胞骨架發(fā)生改變，其對于肝星狀細胞的骨架及收縮活動也是有影響。前人研究給予我們重要的啟示: RAS激活對于在支氣管哮喘支氣管平滑肌高反應性的病理生理發(fā)生發(fā)展中也有重要調節(jié)

6、作用，但是其主要是通過什么信號途徑，而Ang-(1-7)對氣道平滑肌的收縮又有著什么樣的作用，其是否對氣道收縮同樣有著抑制作用，這也是我們要研究證實的問題。
　　 Rho激酶是胞漿中一種小的鳥苷三磷酸酶，稱之為ROCK2，是Rho/ROCK信號通路的重要組分，其與平滑肌細胞收縮表型的保持有著重要的關系?，F階段研究證實，AngⅡ主要是通過Rho/ROCK信號通路發(fā)揮作用誘導平滑肌細胞收縮，而RhoA/ROCK信號通路在過敏性哮喘中

7、氣道高反應性息息相關。Rho/ROCK信號通路廣泛的參與到細胞遷移、增殖、炎癥及細胞骨架、細胞收縮等各個環(huán)節(jié)。肌動蛋白構成的細胞骨架是維持細胞形態(tài)，介導真核細胞必需的生物學功能的重要結構，參與細胞收縮、遷移等多個生物學過程。而Rho/ROCK信號通路中的RhoGTP酶家族作為Ras超家族的成員，是一類能結合GTP的蛋白質，并能通過其下游ROCK2發(fā)揮多種生物學效應，在調節(jié)細胞生命活動的信號通路網中發(fā)揮分子開關的作用。Rho GTP酶家族

8、成員小分子的G蛋白具有GTP酶的活性，在細胞的信號轉導通路中起重要作用，主要調節(jié)細胞增殖、炎癥反應、細胞骨架結構排布及參與細胞收縮等。
　　 綜上所述，RAS的激活與哮喘的發(fā)病息息相關，我們假設在HASMCs上AngⅡ也是通過RhoA/ROCK信號通路發(fā)揮作用誘導平滑肌細胞收縮，及Ang-(1-7)也可以通過調控Rho/ROCK信號通路來調節(jié)人氣道平滑肌細胞的收縮。
　　 二、研究目的
　　 1.使用膠原收縮法在

9、宏觀上證實AngⅡ和Ang-(1-7)對原代培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞收縮的影響，其受體抑制劑是否可阻斷其作用。
　　 2.通過AT-1R抑制劑伊貝沙坦(IRB)、MAS受體抑制劑A779干預進一步證實二者的作用及其作用途徑;ROCK2抑制劑Y-27632證實Rho/ROCK信號通路在其中的作用。
　　 3.通過對各個分組細胞F-actin的染色，證實AngⅡ和Ang-(1-7)及其受體阻斷劑對原代培養(yǎng)的人氣道平滑細胞細胞骨架

10、的作用。
　　 4.通過對Rho/ROCK信號通路關鍵基因ARHGEF、RhoAGTP、ROCK2及蛋白moesin磷酸化水平的檢測，證實其在AngⅡ和Ang-(1-7)調節(jié)HASMCs收縮中的作用。
　　 三、材料和方法
　　 1、經南方醫(yī)院倫理委員會批準，患者同意，取南方醫(yī)院胸外科手術標本，采用貼壁法原代培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞，并進行傳代培養(yǎng)。
　　 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞(Human A

11、irway Smooth MuscleCells，HASMCs)，通過光鏡下觀察細胞形態(tài)和對細胞α-actin特異性免疫熒光染色進行HASMCs鑒定。
　　 3、實驗分組將4-7代人氣道平滑肌細胞分為6組:空白對照組、AngⅡ、AngⅡ+ Ang(1-7)、AngⅡ+Ang-(1-7)+A779、AngⅡ+IRB、AngⅡ+Y-27632。
　　 4、制備含細胞三維膠原，通過宏觀上測量不同分組細胞膠原面積的大小反映分組細

12、胞收縮情況。Image J軟件測量膠原面積，各組面積相對比=(實驗組膠原面積/原始膠原面積)×100％。
　　 5、用羅丹明-鬼筆環(huán)肽標記F-肌動蛋白顯示HASMCs的細胞骨架，使用免疫熒光顯微鏡觀察HASMCs骨架及肌絲的變化進一步在細胞水平上顯示細胞收縮情況。
　　 6、實驗分組:人氣道平滑肌細胞分為5組:空白對照組、AngⅡ、AngⅡ+Ang(1-7)、AngⅡ+IRB、AngⅡ+Y-27632。使用real-ti

13、me PCR方法檢測RhoA/ROCK通路中的關鍵基因RhoGEFs、RhoAGTP、ROCK2 mRNA表達的變化。
　　 7、Western blot檢測AngⅡ在不同時間點對ROCK2底物蛋白moesin磷酸化水平變化。
　　 8、Western blot檢測不同分組對RhoA/ROCK通路關鍵蛋白，ROCK2底物，moesin蛋白磷酸化的影響。
　　 9、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行結果分析，統(tǒng)計數據

14、用均數±標準差((x)±s)表示，組間比較用one way ANOVA分析，先進行方差齊性檢驗，方差齊，選用LSD即最小差異法;若方差不齊，采用校正的F檢驗(Welch法)，并選用Dunnett T3做多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 四、結果
　　 1、倒置顯微鏡下觀察，單個細胞呈梭形、多邊形，融合后的HASMCs呈“峰谷征”“團狀”，形狀規(guī)則。使用α-actin特異性免疫熒光染色胞漿呈綠色，細胞純度在

15、95％以上。
　　 2、膠原收縮實驗證實，各組膠原面積分別為(％):82.56±1.85、42.24+4.38，75.62±1.40、67.95±1.81、76.16±4.46、78.23±2.33(最初膠原面積為100％)。膠原面積與各組細胞收縮呈反比。由此可見，與對照組相比，AngⅡ可顯著誘導HASMcs的收縮(p＜0.05)，Ang-(1-7)可抑制AngⅡ的作用(p＜0.05);二者的受體抑制劑均可阻斷其作用，RhoA/

16、ROCK通路抑制劑Y-27632較Ang-(1-7)和IRB可更顯著抑制AngⅡ誘導的HASMCs收縮(p＜0.05)。
　　 3、羅丹明-鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色顯示，AngⅡ刺激可誘導HASMCs肌絲顯著增多，細胞多呈板狀，呈現出較強張力狀態(tài)。Ang-(1-7)可抑制AngⅡ的作用，細胞肌絲數量減少。IRB可拮抗AngⅡ的作用，A779可拮抗Ang-(1-7)對AngⅡ的抑制作用，細胞肌絲較AngⅡ+ Ang-(1-7)組顯著增

17、加。Y-27632也可顯著抑制AngⅡ誘導的HASMCs肌絲的增加，且多呈絲狀，呈現出較弱的張力狀態(tài)。
　　 4、實時定量PCR顯示，AngⅡ可激活Rho/ROCK信號通路，ARHGEF1、RhoAGTP、ROCK2 mRNA表達顯著增加(p＜0.05)，Ang-(1-7)、ATlR抑制劑IRB與ROCK2抑制劑Y-27632均可顯著抑制其作用(p＜0.05)。
　　 5、Western Blot顯示當AngⅡ濃度為10

18、-7 M時，5min后AngⅡ即可引起moesin蛋白表達水平的增加，15 min后可達到頂峰，之后隨時間增加而逐漸減弱。
　　 6、Western Blot顯示，P-moesin/moesin灰度比值分別為:0.72±0.03、1.48±0.03、0.67+0.03、0.91±0.03、0.61±0.01、0.83±0.02。由此可見AngⅡ可誘導RhoA/ROCK信號通路關鍵蛋白，ROCK2底物moesin磷酸化表達顯著增加