血管緊張素-（1-7）對(duì)血管緊張素Ⅱ致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究目的：本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells. HUVECs)，用血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVECs，與不同濃度的血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]共同孵育，探討Ang-(1-7)對(duì)AngⅡ致HUVECs血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)表達(dá)、細(xì)胞凋亡的影響，并使用Ang-(1-7)特異性受體拮抗劑A-779進(jìn)一步探討Ang

2、-(1-7)的作用機(jī)制，同時(shí)使用NF-кB抑制劑PDTC觀察NF-кB在Ang Ⅱ誘導(dǎo)LOX-1表達(dá)及細(xì)胞凋亡中的作用，為臨床心血管疾病的防治提供理論依據(jù)。 第一部分血管緊張素-(1-7)對(duì)血管緊張素Ⅱ致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1表達(dá)的影響 研究方法：無菌培養(yǎng)HUVECs，采用形態(tài)學(xué)及抗VⅢ因子抗體免疫熒光染色行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。選擇生長良好的第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為：(1)對(duì)照組：不加干預(yù)因素；(2)AngⅡ組：加

3、入不同濃度的AngⅡ(10<'-9>～10<'-6>mol/L)；(3)AngⅡ+Ang-(1-7)組：在加入AngⅡ10<'-6>mol/L基礎(chǔ)上，分別加入不同濃度的Ang-(1-7)(10<'-9>～10<'-6>mol/L)；(4)Ang Ⅱ+Ang-(1-7)+A-779組：用10<'-6>mol/L A-779預(yù)處理30min后，再用終濃度為10<'-9>mol/LAng-(1-7)預(yù)處理30min，最后加入終濃度為 10<'

4、-6>mol/L Ang Ⅱ：(5)Ang Ⅱ+NF-кB抑制劑PDTC組：用PDTC lmmol/L預(yù)處理30min后，再加入終濃度為10<'-6>mol/L Ang Ⅱ。采用半定量RT-PCR檢測(cè)LOX-1 mRNA表達(dá)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)量變化，以標(biāo)記抗體呈陽性的細(xì)胞百分率作為表達(dá)LOX-1蛋白的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。 研究結(jié)果： 1.與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ顯著上調(diào)LOX-1mRNA表達(dá)(0.758±0

5、.018、0.881±0.015、0.987±0.019、1.090v0.023、與對(duì)照組0.387±0.02相比，P<0.05)，流式細(xì)胞術(shù)表明，不同濃度AngⅡ刺激HUVECs 24h后LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)比率增加(22.3％±2.5％、33.2％±3.2％、48.5％±2.75％、62.6％±4.8％，與對(duì)照組17.8％±3.1％相比，P<0.05)，且呈一定的量效關(guān)系；PDTC可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)HUVECs LOX-1mR

6、NA表達(dá)(吸光度值比：1.090Ⅱ0.023比0.543±0.027，P<0.05)和LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)比率(62.6％±4.8％比32.6％±2.3％，P<0.05)。 2.不同濃度的Ang-(1-7)(10<'-9>～10<'-6>mol/L)與10<'-6>mol/L Ang Ⅱ共同培養(yǎng)后可抑制LOX-1mRNA表達(dá)，此作用同Ang-(1-7)的濃度成一定的量效關(guān)系(1.017±0.01、0.798±0.023、0.61

7、9±0.018、0.533±0.01，與Ang Ⅱ組1.089±0.012相比，P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)表明，Ang-(1-7)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)比率，且呈一定的量效關(guān)系(分別為56.9％±2.1％、48.9％±1.3％、37.7％±2.5％、22.8％±2.4％，與Ang Ⅱ組62.2％±2.5％相比，P<0.05)，加入A-779后阻斷Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的LOX-1 mRNA表達(dá)增加(1.025±0.01與Ang

8、Ⅱ組1.089±0.012相比，P>0.05)和LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)比率(60.2％±3.5％與AngⅡ組62.2％±2.5％相比，P>0.05)增加。 第二部分血管緊張素-(1-7)對(duì)血管緊張素Ⅱ致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 研究方法：實(shí)驗(yàn)分組同第一部分，采用吖啶橙/嗅乙錠熒光染色法(AO/EB法)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 研究結(jié)果： 1.熒光顯微鏡下觀察顯示，對(duì)

9、照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富，核呈綠色或黃綠色熒光，Ang Ⅱ處理24h后的綠色熒光強(qiáng)度弱減，紅色熒光明顯加強(qiáng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，胞漿減少。在Ang Ⅱ基礎(chǔ)上加入Ang-(1-7)后，上述作用明顯減弱。 2.流式細(xì)胞儀分析顯示，與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ(10<'-9>～10<'-6>mol/L)呈濃度依賴方式顯著增加HUVECs凋亡率(5.02％±1.01％、10.13％±2.21％、19.46％±3.09％、25.60％±3.17％

10、，與對(duì)照組2.12％±0.24％相比，P<0.05)；PDTC可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs凋亡(9.32％±2.08％與AngⅡ組25.60％±3.17％相比，P<0.05)。 3.Ang-(1-7)(10<'-9>～10<'-6>mol/L)呈量依賴性抑制AngⅡ的促凋亡作用(20.04％±2.21％、16.04％±1.32％、10.04％±2.05％、7.79％±1.50％，與AngⅡ組25.60％±3.17％相比，P

11、<0.05)；加入A-779后，可阻斷Ang-(1-7)的作用(23.37％±0.75％與AngⅡ組25.60％±3.17％相比。P>0.05)。 結(jié)論: 1.AngⅡ明顯增加HUVECs LOX-1mRNA、蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡，NF-кB可能參與了此過程。 2.Ang-(1-7)呈劑量依賴性抑制AngⅡ所誘導(dǎo)的LOX-1蛋白和mRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡。 3.Ang-(1-7)的上述作用是通過特異性受體(M