血管緊張素Ⅱ誘導內皮細胞血管生成的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　心血管疾病是威脅人類健康的第一大殺手，而血管生成在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。大量研究表明動脈粥樣斑塊內血管生成對動脈粥樣硬化性疾病的進展和斑塊的破裂起著非常重要的作用。有研究證實血管緊張素Ⅱ可促進動脈粥樣斑塊的形成和主動脈瘤的破裂;而在動脈粥樣斑塊區(qū)域和動脈瘤破口區(qū)，微血管富集;同時大量的研究亦表明血管緊張素Ⅱ能夠誘導各型內皮細胞的增值、遷移及血管生成。但血管緊張素Ⅱ是如何促血管生成的呢，目前

2、其作用機制仍不明確。
　　然而，近來有研究證實缺血、ox-LDL、血管緊張素Ⅱ等作為刺激因素均能誘發(fā)內質網(wǎng)的非折疊蛋白反應從而誘導內質網(wǎng)應激;在腫瘤和腎臟上皮細胞，非折疊蛋白反應尤其是IRE1信號通路介導血管生成，其主要通過上調VEGF的表達誘導血管生成。故我們設想血管緊張素Ⅱ是否通過AT1受體激活內質網(wǎng)應激的IRE1通路上調VEGF的表達從而誘導內皮細胞生成血管，并進一步探討其中的具體機制。
　　方法:
　　(1)不

3、同濃度的血管緊張素Ⅱ（0nM、0.1nM、1nM、10nM、30nM）處理臍靜脈內皮細胞24小時后，種于matrix膠，37℃孵育16-18小時，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(2)不同濃度的血管緊張素Ⅱ（0nM、0.1nM、1nM、10nM、30nM）處理臍靜脈內皮細胞24小時后，收集胞漿蛋白，Western Blot法檢測GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表達;
　　(3)不同濃度的AT1受體拮抗劑氯沙坦(1uM、3uM

4、、10uM)、AT2受體特異性抑制劑PD123319(10μM)預處理HUVEC1小時后，再加入1nM AngⅡ處理24小時，及PD123319（10μM）、氯沙坦(10uM)單獨處理HUVEC24小時后，收集細胞，種于matrix膠，37℃孵育16-18小時，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(4)氯沙坦(10μM)、IRE1特異性抑制劑irestatin9389(2.5μM)、JNK特異性抑制劑SP600125(10μM)、p38MA

5、PK特異性抑制劑SB203580(10μM)預處理HUVEC1小時后，再加入1nMAngⅡ處理24小時，收集細胞，matrix膠上行血管生成試驗，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(5)氯沙坦（10μM）、irestatin9389(2.5μM)、SP600125（10μM）、SB203580（10μM）預處理HUVEC1小時后，再加入1nMAngⅡ處理24小時，及1nM AngⅡ單獨處理24小時后，收集胞漿蛋白，Western Blot

6、法檢測GRP78、IRE1、JNK、VEGF、p38MAPK的表達;
　　(6)氯沙坦(10μM)、irestatin9389(2.5μM)、SP600125(10μM)、SB203580（10μM）預處理HUVEC1小時后，再加入1nMAngⅡ處理24小時，及1nM AngⅡ單獨處理24小時后，提取細胞RNA，采用半定量PCR檢測GRP78、IRE1、JNK的轉錄水平。
　　結果:
　　(1) AngⅡ誘導內皮細胞的

7、血管生成并觸發(fā)內質網(wǎng)應激:AngⅡ（0.1nM、1nM、10nM、30nM）可促進內皮細胞血管生成，且呈拋物線樣濃度相關性，以1nM時血管生成最為顯著;與促血管生成效應一致，AngⅡ（0.1nM、1nM、10nM、30nM）明顯增加內皮細胞GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表達，且以1nM時最為顯著;
　　(2) AngⅡ通過AT1受體介導內皮細胞的血管生成:AT1受體拮抗劑氯沙坦（1μM，3μM，10μM）呈濃度依賴性的抑制

8、AngⅡ誘導的血管生成，10μM時抑制作用最為明顯;而AT2受體特異性抑制劑PD123319（10μM）對AngⅡ誘導的血管生成無明顯作用;
　　(3)AT1受體/內質網(wǎng)應激途徑在AngⅡ誘導的內皮細胞血管生成中的作用:AT1受體拮抗劑氯沙坦、IRE1特異性抑制劑irestatin9389、JNK特異性抑制劑SP600125、p38MAPK特異性抑制劑SB203580均能抑制AngⅡ誘導的血管生成;
　　(4)AT1受體/內

9、質網(wǎng)應激途徑對AngⅡ誘導的VEGF表達的作用:AngⅡ顯著增加VEGF蛋白水平的表達，而氯沙坦、irestatin9389、SP600125、SB203580均能不同程度的抑制AngⅡ誘導的VEGF蛋白水平的表達;
　　(5) AngⅡ與AT1R/IRE1/JNK/p38MAPKs途徑的關系:氯沙坦可抑制AngⅡ誘導的GRP78蛋白水平及mRNA的表達，而irestatin9389、SP600125、SB203580均無此抑制作

10、用;氯沙坦、irestatin9389均能抑制AngⅡ誘導的IRE1蛋白水平及mRNA的表達，而SP600125、SB203580對IRE1的表達無影響;氯沙坦、irestatin9389、SP600125均能抑制AngⅡ誘導的JNK蛋白水平及mRNA的表達，而SB203580對此無影響;以上所有抑制劑均能抑制AngⅡ誘導的p38MAPK蛋白水平的表達。
　　結論:
　　AngⅡ可通過AT1受體激活內質網(wǎng)應激IRE1/JNK