血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　心血管疾病是威脅人類健康的第一大殺手，而血管生成在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。大量研究表明動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)血管生成對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)展和斑塊的破裂起著非常重要的作用。有研究證實(shí)血管緊張素Ⅱ可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和主動(dòng)脈瘤的破裂;而在動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)域和動(dòng)脈瘤破口區(qū)，微血管富集;同時(shí)大量的研究亦表明血管緊張素Ⅱ能夠誘導(dǎo)各型內(nèi)皮細(xì)胞的增值、遷移及血管生成。但血管緊張素Ⅱ是如何促血管生成的呢，目前

2、其作用機(jī)制仍不明確。
　　然而，近來有研究證實(shí)缺血、ox-LDL、血管緊張素Ⅱ等作為刺激因素均能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非折疊蛋白反應(yīng)從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;在腫瘤和腎臟上皮細(xì)胞，非折疊蛋白反應(yīng)尤其是IRE1信號(hào)通路介導(dǎo)血管生成，其主要通過上調(diào)VEGF的表達(dá)誘導(dǎo)血管生成。故我們?cè)O(shè)想血管緊張素Ⅱ是否通過AT1受體激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1通路上調(diào)VEGF的表達(dá)從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管，并進(jìn)一步探討其中的具體機(jī)制。
　　方法:
　　(1)不

3、同濃度的血管緊張素Ⅱ（0nM、0.1nM、1nM、10nM、30nM）處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，種于matrix膠，37℃孵育16-18小時(shí)，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(2)不同濃度的血管緊張素Ⅱ（0nM、0.1nM、1nM、10nM、30nM）處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，收集胞漿蛋白，Western Blot法檢測(cè)GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表達(dá);
　　(3)不同濃度的AT1受體拮抗劑氯沙坦(1uM、3uM

4、、10uM)、AT2受體特異性抑制劑PD123319(10μM)預(yù)處理HUVEC1小時(shí)后，再加入1nM AngⅡ處理24小時(shí)，及PD123319（10μM）、氯沙坦(10uM)單獨(dú)處理HUVEC24小時(shí)后，收集細(xì)胞，種于matrix膠，37℃孵育16-18小時(shí)，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(4)氯沙坦(10μM)、IRE1特異性抑制劑irestatin9389(2.5μM)、JNK特異性抑制劑SP600125(10μM)、p38MA

5、PK特異性抑制劑SB203580(10μM)預(yù)處理HUVEC1小時(shí)后，再加入1nMAngⅡ處理24小時(shí)，收集細(xì)胞，matrix膠上行血管生成試驗(yàn)，顯微鏡下觀察并拍照;
　　(5)氯沙坦（10μM）、irestatin9389(2.5μM)、SP600125（10μM）、SB203580（10μM）預(yù)處理HUVEC1小時(shí)后，再加入1nMAngⅡ處理24小時(shí)，及1nM AngⅡ單獨(dú)處理24小時(shí)后，收集胞漿蛋白，Western Blot

6、法檢測(cè)GRP78、IRE1、JNK、VEGF、p38MAPK的表達(dá);
　　(6)氯沙坦(10μM)、irestatin9389(2.5μM)、SP600125(10μM)、SB203580（10μM）預(yù)處理HUVEC1小時(shí)后，再加入1nMAngⅡ處理24小時(shí)，及1nM AngⅡ單獨(dú)處理24小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA，采用半定量PCR檢測(cè)GRP78、IRE1、JNK的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:
　　(1) AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的

7、血管生成并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激:AngⅡ（0.1nM、1nM、10nM、30nM）可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，且呈拋物線樣濃度相關(guān)性，以1nM時(shí)血管生成最為顯著;與促血管生成效應(yīng)一致，AngⅡ（0.1nM、1nM、10nM、30nM）明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞GRP78、IRE1、JNK蛋白水平的表達(dá)，且以1nM時(shí)最為顯著;
　　(2) AngⅡ通過AT1受體介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成:AT1受體拮抗劑氯沙坦（1μM，3μM，10μM）呈濃度依賴性的抑制

8、AngⅡ誘導(dǎo)的血管生成，10μM時(shí)抑制作用最為明顯;而AT2受體特異性抑制劑PD123319（10μM）對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的血管生成無明顯作用;
　　(3)AT1受體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的作用:AT1受體拮抗劑氯沙坦、IRE1特異性抑制劑irestatin9389、JNK特異性抑制劑SP600125、p38MAPK特異性抑制劑SB203580均能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管生成;
　　(4)AT1受體/內(nèi)

9、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)的作用:AngⅡ顯著增加VEGF蛋白水平的表達(dá)，而氯沙坦、irestatin9389、SP600125、SB203580均能不同程度的抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VEGF蛋白水平的表達(dá);
　　(5) AngⅡ與AT1R/IRE1/JNK/p38MAPKs途徑的關(guān)系:氯沙坦可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的GRP78蛋白水平及mRNA的表達(dá)，而irestatin9389、SP600125、SB203580均無此抑制作

10、用;氯沙坦、irestatin9389均能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的IRE1蛋白水平及mRNA的表達(dá)，而SP600125、SB203580對(duì)IRE1的表達(dá)無影響;氯沙坦、irestatin9389、SP600125均能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的JNK蛋白水平及mRNA的表達(dá)，而SB203580對(duì)此無影響;以上所有抑制劑均能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p38MAPK蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　AngⅡ可通過AT1受體激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1/JNK