血管緊張素Ⅱ?qū)ν庵苎獌?nèi)皮祖細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型特征的前體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。干細(xì)胞因子(SCF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、HMG-coA還原酶抑制劑、粒系巨噬系集落刺激因子(GMCSF)等都能自骨髓動(dòng)員EPC，并促進(jìn)其增殖、分化、粘附和遷移能力。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的一種

2、主要活性物質(zhì)，其生物學(xué)作用主要是調(diào)節(jié)機(jī)體水、電解質(zhì)和血壓的平衡。而許多研究提示AngⅡ還能刺激一系列細(xì)胞的增殖、分化，可能參與調(diào)控造血細(xì)胞(HPC)、血管平滑肌細(xì)胞等的生長(zhǎng)(SMC)，并可能參與調(diào)控血管新生過程。本研究的目的是觀察AngⅡ是否影響外周血EPC的數(shù)量；是否改變了EPC的增殖功能、遷移功能及粘附能力；AngⅡ?qū)PC的體外血管生成能力的影響程度；同時(shí)觀察AngⅡ是否影響EPC的VEGF受體-2/KDRmRNA的表達(dá)以及Ang

3、Ⅱ的Ⅰ型受體拮抗劑(纈沙坦)能否影響AngⅡ?qū)PC的作用，從而探討AngⅡ是否通過AT1受體上調(diào)VEGF受體-2/KDRmRNA的水平，從而影響EPC的數(shù)量、功能。 方法：1、EPC的分離、培養(yǎng)：取健康成人空腹外周靜脈血20ml，用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)7天，收集貼壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成5組：①對(duì)照組；②AngⅡ各濃度組(共3組)：在培養(yǎng)液中分別加入10-5mol/L，10-7mol/L，10-9mol/LAng

4、Ⅱ，其中10-5mol/LAngⅡ組觀察不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h及48h)；③纈沙坦組：在培養(yǎng)液中加入1×10-5mol/L的纈沙坦預(yù)作用1/2h后，再加入1×10-5mol/L的AngⅡ培養(yǎng)24h。 2.細(xì)胞染色與鑒定：細(xì)胞與acLDL-DiI37℃孵育1h以檢測(cè)EPC對(duì)DiLDL的攝取。采用多波長(zhǎng)激光共聚焦顯微鏡(LSCM)鑒定UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPC。采用倒置熒光顯微鏡對(duì)每孔進(jìn)行計(jì)

5、數(shù)。 3.細(xì)胞表型檢測(cè)：將2×105貼壁細(xì)胞分別與PE標(biāo)記的VEGFR-2、AC133和CD34單克隆抗體，在4℃孵育30min后，用300μLPBS懸浮細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。 4.EPC粘附能力檢測(cè)：收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，然后將等量EPC接種到包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)30min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。 5.EPC遷移能力檢測(cè)：收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將25μL培養(yǎng)液和VEGF(50ng/mL

6、)加入改良的Boyden小室的下室，將2×104EPC懸浮5在50μL培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。 6.EPC增殖能力檢測(cè)：采用MTT比色法測(cè)定EPC的增殖能力。收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。再將等量EPC接種到包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，每孔加10μLMTT(5mg/ml)，培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(150μL/孔)，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)

7、490nm處測(cè)OD值。 7.體外血管生成能力檢測(cè)：采用體外血管生成試劑盒檢測(cè)EPC的血管生成能力。將ECMatrixTM膠液和ECM10×稀釋液凍融按比例混勻、成膠。0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞獲取EPC，并重新懸浮于培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/mL。將EPC接種于ECMatrixTM膠上。37℃培養(yǎng)24h，在200倍倒置顯微鏡下觀察小(血)管生成情況，隨機(jī)選擇5個(gè)顯微鏡視野(×200)，計(jì)數(shù)小管數(shù)。 8.KDRm

8、RNA的表達(dá)的測(cè)定：收集貼壁細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，以RT-PCR法對(duì)EPC的KDRmRNA表達(dá)進(jìn)行半定量測(cè)定。 結(jié)果：1.AngⅡ?qū)ν庵苎狤PC數(shù)量的影響：EPC數(shù)量在AngⅡ作用6h后開始顯著增加(p＜0.05)，24h到高峰(P＜0.01)，48h時(shí)略有下降，但仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，AngⅡ10-5mol/L時(shí)達(dá)最大效應(yīng)(P＜0.01)； 62.AngⅡ?qū)ν庵苎狤PCs粘附能力的影響：AngⅡ

9、增強(qiáng)EPC粘附能力，6h開始明顯增加(P＜0.05)，于24h達(dá)到高峰(P＜0.01)，在10-5mol/L時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(P＜0.01)； 3.AngⅡ?qū)ν庵苎狤PC遷移功能的影響：AngⅡ可提高EPC的遷移能力，12h開始明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，于24h達(dá)到高峰(P＜0.01)，10-5mol/L時(shí)最為顯著(P＜0.01)； 4.AngⅡ?qū)ν庵苎狤PC增殖功能的影響：EPC的增殖能力在AngⅡ刺激后12h開始明顯增

10、強(qiáng)(P＜0.05)，于24h達(dá)到高峰(P＜0.01)，48h有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，在濃度為10-5mol/L時(shí)最為顯著(P＜0.01)； 5.AngⅡ?qū)ν庵苎狤PC體外血管生成能力的影響：體外血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)血管生成，檢測(cè)EPC參與血管新生的能力。結(jié)果顯示，AngⅡ顯著增強(qiáng)EPC的體外血管生成能力，在濃度為10-5mol/L時(shí)最為顯著，并且形成的管腔樣結(jié)構(gòu)也較對(duì)照組更復(fù)雜。 6.AngⅡ?qū)ν庵?/p>

11、血EPCVEGF受體2(KDR)mRNA表達(dá)的影響：AngⅡ呈劑量、時(shí)間依賴方式刺激EPCKDRmRNA的表達(dá)。于24h達(dá)到高峰(P＜0.01)，在10-5mol/L時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(P＜0.01)。 7.纈沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的外周血EPC數(shù)量和功能改變的影響：纈沙坦明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的外周血EPC數(shù)量和功能的改變以及KDRmRNA的表達(dá)，使之接近于基礎(chǔ)水平(與對(duì)照組比較p＞0.05)。 結(jié)論：1.AngⅡ在體外能增加E

12、PC數(shù)量，作用呈濃度和時(shí)間依賴性； 72.AngⅡ在體外能改善EPC的增殖、遷移、粘附能力，作用呈濃度和時(shí)間依賴性； 3.AngⅡ能提高EPC的體外血管生成能力； 4.AngⅡ呈劑量、時(shí)間依賴方式刺激EPCKDRmRNA表達(dá)； 5.纈沙坦可顯著抑制AngⅡ的上述作用。提示AngⅡ能通過AT1受體上調(diào)VEGF受體-2/KDRmRNA的水平，從而增加EPC的數(shù)量、促進(jìn)EPC的功能； 6.提示AngⅡ可