同型半胱氨酸對外周血內皮祖細胞的影響及其機制探討.pdf

1、冠心病嚴重危害人類健康,其傳統(tǒng)危險因素包括吸煙、高血壓、高血脂、高血糖和肥胖等.新近研究證實血漿同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高也是冠心病一個獨立危險因素.高Hcy參與冠心病發(fā)病的多個環(huán)節(jié),機制十分復雜,其中內皮功能障礙是高Hcy導致冠心病的中心環(huán)節(jié).內皮功能障礙的本質是內皮損傷和修復之間動態(tài)平衡的破壞,而內皮祖細胞(endothelial progenitor cell,EPC)在內皮損傷后的修復中起重要作用.

2、EPC是一類能增殖并分化為血管內皮細胞,但尚未表達成熟血管內皮細胞表型,也未形成血管的前體細胞.研究發(fā)現(xiàn),EPC不僅參與人胚胎血管生成,同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程.近來研究表明EPC在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色.Vasa和Hill分別報道冠心病患者循環(huán)血中的EPC數(shù)量下降了近50﹪,遷移能力受損,并與危險因子的數(shù)目成反向線性關系,而且高危者EPC更易老化.引起冠心病患者EPC數(shù)量減少的確切機制尚不明確,可能與

3、患者長期暴露于冠心病的危險因素有關.隨后的進一步研究顯示糖尿病、高血壓、高膽固醇、老齡化及吸煙等冠心病危險因素確實對循環(huán)EPC數(shù)量和活性具有明顯抑制作用.基于上述理論,我們提出假設:高Hey不但直接損傷血管內皮,可能同時影響EPC的數(shù)量和功能,繼而影響內皮修復能力,打破內皮損傷和修復之間的動態(tài)平衡,導致內皮功能障礙,促發(fā)冠心病發(fā)生.國內外尚無有關高Hey對EPC影響的研究報道,我們如能完成這方面的研究,這不但將豐富冠心病的發(fā)病理論,同時

4、將為EPC在冠心病防治的臨床應用提供理論依據(jù)和直接技術保障.為此,我們首先觀察了Hey體外干預對外周血EPC數(shù)量和功能的影響,然后進一步觀察了高Hey血癥患者外周血EPC數(shù)量和功能的變化,最后探討了Hey影響EPC的可能機制.以下分三部分對本研究的方法、結果以及結論作一簡述. 第一部分 同型半胱氨酸對外周血內皮祖細胞數(shù)量和功能的影響 目的:觀察Hey體外干預對外周血EPC數(shù)量和功能的影響. 方法:采用密度梯度離心

5、法從外周血獲取單個核細胞,將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板,培養(yǎng) 7d 后,收集貼壁細胞,加入不同濃度 Hey (10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L 和 200μmol/L )干預24h,觀察量效關系.此外,200μmol/LHey分別干預不用時間(6h,12h,24h和48h),觀察時效關系.多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acIDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPC,流式細胞儀檢測其表面

6、標志進一步鑒定EPC,倒置熒光顯微鏡下計數(shù).采用MTT.比色法、改良的Boyden小室、粘附能力測定實驗和體外血管生成試劑盒分別觀察EPC的增殖能力、遷移能力、粘附能力和體外血管生成能力. 結論:Hey可減少EPC數(shù)量并損害EPC功能,且Hcy對EPC的影響呈一定的量效和時效關系. 第二部分 高同型半胱氨酸血癥患者循環(huán)內皮祖細胞的變化 目的:觀察高Hcy血癥患者外周血EPC數(shù)量和功能的變化. 方法:入選患

7、者60例,均為本院住院患者,其中高Hcy血癥患者組30例,對照組為30例非高Hey血癥患者,兩組研究對象的臨床資料基本匹配.采用全自動熒光偏振免疫分析法檢測血漿Hcy,流式細胞儀計數(shù)循環(huán)EPC(即AC133<'+>KDR<'+>細胞).此外,采用密度梯度離心法從外周血獲取單個核細胞,將其接種在人纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板,培養(yǎng)4d后貼壁細胞進行細胞化學分析.激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-aeLDL雙染色陽性細胞為正在分化

8、的EPC.采用改良的Boyden小室和粘附能力測定實驗觀察EPC的遷移和粘附能力. 結論:高Hey血癥患者外周血EPC數(shù)量減少、功能減退,且EPC的數(shù)量和功能與血Hcy水平呈反向線性關系. 第三部分 同型半胱氨酸影響內皮祖細胞機制的探討 目的:探討Hcy影響EPC數(shù)量和功能的可能機制. 方法:采用密度梯度離心法從外周血獲取單個核細胞,將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板,培養(yǎng)4d后,收集貼壁細胞,加入不同

9、濃度Hey(10μmol/L,30μmol/L,100μmol/L.和200μmol/L)干預,或先予以1μmol/L阿托伐他汀預處理1h,然后再用200μmol/LHey干預.多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL,雙染色陽性細胞為正在分化的EPC,流式細胞儀檢測其表面標志進一步鑒定EPC.采用SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老細胞,細胞增殖ELISA試劑盒和集落生成能力測定實驗檢測EPC的增殖能力和集

10、落形成能力,端粒重復序列擴增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)-ELISA定量檢測端粒酶活性,TRAP-聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)-銀染法定性檢測端粒酶活性,Western blot檢測EPC Akt Ser<,473>磷酸化水平. 結論:Hey加速EPC衰老,伴隨EPC增殖和集落形成能力的損害.Hey加速EPC衰老可能跟EPC端粒酶活性下降以及Akt磷酸化水平的下