蛋氨酸負(fù)載對大鼠肝細(xì)胞同型半胱氨酸代謝的影響.pdf

1、目的
　　體外培養(yǎng)正常BRL大鼠肝細(xì)胞,進(jìn)行蛋氨酸負(fù)載(methionineloading)后,測定Hcy相關(guān)代謝物及代謝酶的變化,探討蛋氨酸負(fù)載對大鼠肝細(xì)胞Hcy相關(guān)代謝途徑的影響并探討其相關(guān)機(jī)制,以建立高同型半胱氨酸細(xì)胞模型,為進(jìn)一步研究高同型半胱氨酸血癥的營養(yǎng)干預(yù)及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.采用含10％胎牛血清的培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)BRL大鼠肝細(xì)胞。
　　2.采用MTT法檢測不同濃度Met負(fù)載對肝細(xì)胞存

2、活率的影響。
　　3.采用HPLC法檢測肝細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中Hcy及相關(guān)代謝物的含量。
　　4.采用氨基酸自動分析儀檢測培養(yǎng)液中與Hcy代謝相關(guān)的氨基酸含量及細(xì)胞內(nèi)BHMT活性。
　　5.采用HPLC法測定細(xì)胞內(nèi)SAM、SAH含量及SAHH活性。
　　6.采用分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)CBS和MS活性。
　　結(jié)果
　　1.分別以10、20、50、100、200mmol/LMet作用于BRL大鼠肝細(xì)胞1、2、3

3、、4h后,檢測肝細(xì)胞存活率的變化。當(dāng)Met濃度≤100mmol/L時,各時間點內(nèi)肝細(xì)胞的存活率均在91.8%以上。
　　2.20、50、100mmol/LMet分別作用于肝細(xì)胞后,20、50mmol/LMet組Hcy的生成量在1～4h內(nèi)基本持平,而100mmol/LMet組隨時間延長Hcy的生成量有增加的趨勢。因此,選擇20、50mmol/LMet作用于肝細(xì)胞1h為Met負(fù)載模型的條件。
　　3.與空白對照組相比,20mmo

4、l/LMet組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、Ser、胱氨酸的含量顯著增加(P<0.05),Glu、Gly、Tau的含量顯著減少(P<0.05);50mmol/LMet組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、胱氨酸的含量顯著增加(P<0.05),Glu、Gly的含量顯著減少(P<0.05)。與20mmol/LMet組相比,50mmol/LMet組培養(yǎng)液中Hcy、Cys、GSH、Gly和Tau的含量顯著增加(P<0.05),Ser的含量顯著減少(P<0.05)

5、。
　　4.與空白對照組相比,20和50mmol/LMet組SAM含量、SAM/SAH比值、SAHH的水解與合成活性均顯著增加(P<0.05);BHMT活性顯著降低(P<0.05);20mmol/LMet組的MS活性顯著降低(P<0.05);50mmol/LMet組的SAH含量顯著減少(P<0.05)。與20mmol/LMet組相比,50mmol/LMet組SAM和SAH的含量顯著減少(P<0.05),SAM/SAH比值顯著增加(

6、P<0.05)。
　　結(jié)論
　　1.成功建立了Met負(fù)載大鼠肝細(xì)胞模型。
　　2.對培養(yǎng)液中Hcy及其代謝相關(guān)的一些氨基酸的含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,Met負(fù)載顯著增加Hcy、Cys含量,影響Glu、Gly、Ser的含量,提示高M(jìn)et負(fù)載后Hcy及其代謝相關(guān)的一些氨基酸的含量均發(fā)生變化。
　　3.進(jìn)一步對肝細(xì)胞勻漿中Hcy代謝相關(guān)物質(zhì)SAM、SAH的含量和Hcy代謝相關(guān)酶SAHH、MS、BHMT、CBS活性進(jìn)行分析