葉酸對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　多種血管疾病的初期均會(huì)出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的病理生理改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一，因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于防治AS相關(guān)疾病有著重要的意義。流行病學(xué)研究和基礎(chǔ)研究均表明在AS的發(fā)生早期常伴有高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteine， HHcy）。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生。葉酸

2、作為輔酶參與Hcy代謝。本研究觀察葉酸（folic acid， FA）對(duì)Hcy引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）損傷的保護(hù)作用，探討其中機(jī)制，為AS防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度葉酸（0-1000 nmol/L）作用于HUVEC48 h（前24h同時(shí)進(jìn)行1000μmol/L Hcy孵育及空白對(duì)照）。分別采用MTT法檢測(cè)不

3、同濃度葉酸作用下 HUVEC細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；丙二醛（ methane dicarboxylic aldehyde，MDA）測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測(cè)細(xì)胞中葉酸水平；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Hcy、S-

4、腺苷同型半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine，SAH）和S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，SAM)水平；RT-PCR檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的mRNA表達(dá)水平；免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)VEG

5、F、MCP-1的蛋白表達(dá)水平；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的總抗氧化能力；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞 SOD活性；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中GSH含量；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞GSH-Px活性；流

6、式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；RT-PCR檢測(cè)抑制凋亡基因Bcl2的mRNA水平和促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6、Caspase-8和Caspase-9的mRNA水平；Caspase-3/7檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3/7活性。
　　結(jié)果：
　　與正常對(duì)照組（葉酸濃度為20 nmol/L）相比，Hcy干預(yù)降低了細(xì)胞活性，升高了細(xì)胞生長(zhǎng)

7、抑制率。對(duì)照組細(xì)胞排列整齊緊密，Hcy干預(yù)后細(xì)胞排列疏松。葉酸干預(yù)使細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞數(shù)目顯著增多，且葉酸高劑量組作用最明顯。葉酸作用于Hcy孵育的細(xì)胞后，增強(qiáng)了細(xì)胞活性，降低了細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。葉酸干預(yù)降低了細(xì)胞氧化損傷程度，與 Hcy+FA-N組相比，Hcy+FA-H組細(xì)胞MDA含量減少、LDH活性降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。葉酸增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，與Hcy+FA-N組相比，Hcy+FA-H組細(xì)胞總抗氧化能力（

8、T-AOC）、SOD活性、細(xì)胞內(nèi)GSH含量和GSH-Px活性均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。葉酸降低了細(xì)胞中Hcy、SAH濃度，升高了SAM濃度。葉酸可提高VEGF的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，降低MCP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。葉酸上調(diào)了抑制凋亡基因Bcl2的mRNA表達(dá)水平，下調(diào)了促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4和Caspase-8的mRNA表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。促凋亡

9、基因Caspase-6和Caspase-9的mRNA水平在各組之間無(wú)差異（P＞0.05）。葉酸降低了細(xì)胞的Caspase-3/7活性。
　　結(jié)論：
　　葉酸可改善由 Hcy引起的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活性，降低生長(zhǎng)抑制率，改善內(nèi)皮功能，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞凋亡率，葉酸對(duì) Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。其可能的機(jī)制為葉酸通過(guò)調(diào)節(jié)與AS進(jìn)展相關(guān)的VEGF和MCP-1的基因和蛋白的表達(dá)水平改善內(nèi)皮功能；葉酸通過(guò)