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文檔簡介
1、目的:
探討高同型半胱氨酸對葉酸受體基因表達(dá)的影響。觀察沉默葉酸受體α對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的影響,探討這一過程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中較關(guān)鍵的靶蛋白PERK激活的關(guān)系。
方法:
1、用0μM/L、50μM/L、100μM/L、200μM/L、500μM/L幾種不同濃度的同型半胱氨酸干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞:24小時后倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生的變化;CCK-8法檢測各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的存活率;R
2、eal-timeqPCR法檢測各組細(xì)胞5種葉酸受體基因FOLR1、FOLR2、FOLR3、SLC46A1、SLC19A1的mRNA表達(dá)水平;Westernblot法檢測FRα的蛋白表達(dá)水平。
2、脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HUVECs后,用熒光顯微鏡觀察HUVECs內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況,并用Westernblot法檢測FRα蛋白的表達(dá),篩選出轉(zhuǎn)染效果最佳的FRα-siRNA片段。
3、將實驗分為空白對照組、陰性對
3、照siRNA組、FRα-siRNA組。AnnexinV+PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs的細(xì)胞凋亡率,westernblot檢測PERK及p-PERK蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1、隨著Hcy濃度的升高,HUVECs在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)損傷變化,細(xì)胞生存率逐漸降低。當(dāng)Hcy>50μM/L時,作用24小時后,HUVECs的生存率較空白對照組逐漸下降(P<0.05),濃度越高,細(xì)胞生存率越低,各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
4、。
2、在HUVECs中,F(xiàn)OLR2、FOLR3特別是FOLR2的mRNA表達(dá)量非常低。隨著Hcy濃度的升高,F(xiàn)OLR1mRNA表達(dá)量分別先升高后降低,SLC46A1的mRNA表達(dá)量先升高后趨于不變。FOLR1、SLC46A1、SLC19A1mRNA相對表達(dá)量均在50μM/LHcy干預(yù)組達(dá)到各組的峰值,與各組的空白對照組的相比升高(P<0.05)。200μM/LHcy干預(yù)組的FOLR1mRNA相對表達(dá)量與空白對照組相比下降(P
5、<0.05)。
3、隨著Hcy濃度的升高,F(xiàn)Rα蛋白呈現(xiàn)先升高后降低的變化,50μM/LHcy干預(yù)時達(dá)到峰值。與空白對照組相比,50μM/LHcy干預(yù)組FRα蛋白表達(dá)量增加(P<0.01),200μM/LHcy干預(yù)組FRα蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。100μM/LHcy干預(yù)組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。100μM/LHcy干預(yù)組、200μM/LHcy干預(yù)組的FRα蛋白表達(dá)量低于50μM/LHcy干預(yù)組(
6、P<0.01)。200μM/LHcy干預(yù)組的FRα蛋白表達(dá)量低于100μM/LHcy干預(yù)組(P<0.01)。
4、倒置熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染陰性對照片段、3種FR-siRNA干擾片段FOLR1-homo-132、FOLR1-homo-272、FOLR1-homo-597的HUVECs均可觀察到綠色熒光,平均轉(zhuǎn)染效率75%。Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后FRα蛋白的表達(dá)抑制情況,3種FRα干擾片段均能有效抑制FRα在人臍靜脈內(nèi)皮
7、細(xì)胞中的表達(dá),其中FOLR1-homo-132干擾片段抑制效率最高,計算蛋白抑制率為87.19%。
5、流式細(xì)胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs12h后,空白對照組、陰性對照組、FRα干擾組細(xì)胞的凋亡率(%)分別為:3.56±1.2、5.12±2.1、20.6±3.0。FRα干擾組與陰性片段轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比,凋亡率增加(P<0.01)。
6、Westernblot測得空白對照組p-PERK的蛋白表達(dá)量低;FRα
8、干組與空白對照組、陰性對照組相比,p-PERK的蛋白表達(dá)量增加,p-PERK/PERK比值升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
結(jié)論:
1、同型半胱氨酸可以使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生損傷性變化,降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞生存率,這種作用具有劑量依賴性。
2、FOLR2、FOLR3特別是FOLR2的mRNA表達(dá)量在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中非常低。同型半胱氨酸可以對FOLR1、SLC46A1、SLC19A1的
9、mRNA在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有先促進(jìn)再抑制的作用。
3、濃度不斷升高的同型半胱氨酸可以影響以FRα為代表的葉酸受體的表達(dá),對FRα的mRNA及蛋白表達(dá)呈先促進(jìn)再抑制的作用,其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。
4、沉默F(xiàn)Rα能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
5、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的標(biāo)志分子PERK可能參與了沉默F(xiàn)Rα的表達(dá)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的過程。
6、FRα可能是高同型半胱氨酸損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)
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