JNK信號(hào)通路在同型半胱氨酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、[目的] 1、研究不同濃度同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡影響,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)特異性抑制劑(SP600125)干預(yù)對(duì)Hcy誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的拮抗作用. 2、探討JNK信號(hào)途徑在同型半胱氨酸誘導(dǎo)的HUVECs凋亡可能的作用機(jī)制. 3、觀察Hcy誘導(dǎo)的人HUVECs單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MC

2、P-1)的產(chǎn)生以及SP600125對(duì)它的影響. [方法] 1、HUVECs用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),將實(shí)驗(yàn)分八組:正常對(duì)照組(A組)、0.1mmol/L Hcy組(B組)、0.3mmol/L Hcy組(C組)、1.0mmol/L Hcy組(D組)、3.0mmol/LHcy組(E組)、10.0mmol/L Hcy組(F組)、10.0mmol/L Hey+1.0umol/1 SP600 125組(G組)和10.0mmo

3、l/L Hcy+10.0umol/1 SP600125組(H組);將G組和H組HUVECs用SP600125預(yù)處理1小時(shí)后,再用上述各種濃度的Hcy繼續(xù)培養(yǎng)24h,分別利用TUNEL染色方法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況. 2、應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞的JNK的表達(dá),觀察0.1mmol/L及10.0mmol/L Hcy刺激后15min、30min、1h、2h、4h及8h,JNK磷酸化水平隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化;觀察0.1、

4、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy刺激后2h,JNK磷酸化水平隨Hcy刺激濃度的動(dòng)態(tài)變化;觀察不同濃度SP600125(1.0、10.0 μM)對(duì)10.0mmol/LHcy誘導(dǎo)HUVECsJNK磷酸化的影響. 3、應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)HUVECs在0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy誘導(dǎo)下MCP-1的產(chǎn)生,觀察SP600125(1.0、10.0 μm)對(duì)10.0mmol/L Hcy誘導(dǎo)

5、HUVECs釋放MCP-1的影響. [結(jié)果] 1、TUNEL染色凋亡檢測(cè)方法結(jié)果:B組對(duì)HUVECs凋亡無(wú)影響,與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),0.3mmol/L Hcy可以引起明顯細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01),在F組Hcy的促凋亡作用最強(qiáng),細(xì)胞凋亡率達(dá)到40.21±1.30﹪.SP600125干預(yù)處理能減少細(xì)胞凋亡數(shù)目,與相應(yīng)無(wú)SP600125干預(yù)組比較有顯著性差異(P<0.0 1),而

6、且SP600125干預(yù)組之間比較有顯著性差異(P<0.01). 2、Western Blot檢測(cè)Hcy刺激HUVECsJNK磷酸化時(shí)間動(dòng)態(tài)變化:0.1mmol/L刺激時(shí),15rain也明顯磷酸化,持續(xù)至4h,并且隨后JNK磷酸化水平出現(xiàn)下降,高峰發(fā)生在2h,3.00±0.19倍于對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),8h回到接近于對(duì)照組水平;10.0mmol/L刺激時(shí),15minJNK明顯磷酸化,持續(xù)至8h,高峰發(fā)生在2

7、h～4h,6.56±0.38倍于對(duì)照組水平(P<0.01),2h與4h之間無(wú)顯著性差異(P>0.05);兩者均在30min出現(xiàn)了短暫的下降期. 3、不同濃度Hey刺激的HUVECsJNK磷酸化的結(jié)果:與Hcy存在明顯的濃度依賴關(guān)系,0.1mmol/LHcy時(shí)就出現(xiàn)了JNK明顯磷酸化,10.0mmol/L Hcy誘導(dǎo)下JNK最強(qiáng)的活化,相比于對(duì)照組,6.11±0.6l倍的升高(P<0.01). 4、不同濃度SP600125

8、抑制Hcy誘導(dǎo)的JNK的磷酸化:SP600125以濃度依賴性的方式抑制Hcy誘導(dǎo)HUVECs中JNK的磷酸化(P<0.01). 5、細(xì)胞上清中MCP-1的含量:MCP-1的釋放水平與Hcy存在明顯的濃度依賴關(guān)系,10.0mmol/L Hcy誘導(dǎo)下MCP-1水平最高(相比對(duì)照組,P<0.01),SP600125干預(yù)處理能減少細(xì)胞MCP-1的釋放,與相應(yīng)無(wú)SP600125干預(yù)組比較有顯著性差異(P<0.01),而且SP600125干

9、預(yù)組之間比較有顯著性差異(P<0.01). [結(jié)論] 1、Hcy對(duì)離體培養(yǎng)的HUVECs增殖具有抑制作用,濃度為0.3mmol/L時(shí)即能促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡,該作用隨著Hcy濃度的增加而增強(qiáng),濃度為10.0mmol/L時(shí)最顯著;SP600125能拮抗Hcy誘導(dǎo)的HUVECs凋亡作用. 2、Hcy能增強(qiáng)HUVECs的JNK的表達(dá),Hey與JNK的表達(dá)呈時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系,而且濃度越高持續(xù)時(shí)間越久.SP600125則