平陽霉素對人臍靜脈內皮細胞的凋亡作用機制.pdf

1、血管瘤是最常見的良性血管病變，分為毛細血管瘤、海綿狀血管瘤、蔓狀血管瘤和混合性血管瘤。頭頸部體表及腔內血管瘤，嚴重影響患者的容貌和器官功能，甚至并發(fā)大出血或呼吸道梗阻而危及患者生命，需要及時治療。目前國內外對血管瘤的治療主要包括口服藥物、局部藥物注射、激光、手術切除等，然而單純的激光或手術治療很難將血管瘤完整的切除，并且可能會對患者的容貌和頭面部器官的功能造成一定的影響。局部注射治療操作簡單、療效顯著，成為近年來國內外血管瘤治療最為推崇

2、的治療手段之一，其中比較常用的藥物有平陽霉素、聚桂醇、普萘洛爾等。平陽霉素是由我國學者自主研制并投入臨床應用的抗腫瘤藥物，其化學名稱為N-[3-（4-氨基丁酸）氨基]丙氨基博來霉素A5，是博來霉素類抗腫瘤抗生素藥物的新品種。據報道，平陽霉素瘤體內注射治療頭頸部體表及腔內血管瘤副作用小、療效顯著;地塞米松聯合平陽霉素瘤體內注射，具有療效增強作用。然而平陽霉素、平陽霉素聯合地塞米治療血管瘤的確切機制仍然不清楚。
　　研究發(fā)現平陽霉素能

3、夠誘導血管內皮細胞凋亡，細胞凋亡的途徑有內質網應激凋亡途徑、死亡受體信號途徑和線粒體途徑，平陽霉素誘導內皮細胞凋亡是通過哪種途徑進行的，仍未見國內外相關文獻報道。
　　血管瘤是由過度增生的血管內皮細胞引起的，HUVEC為人臍靜脈血管內皮細胞，具有干細胞的潛能。我們以體外培養(yǎng)的HUVEC作為模型，通過流式細胞儀和蛋白免疫印跡研究平陽霉素誘導HUVEC細胞凋亡的機制，以及平陽霉素聯合地塞米松對HUVEC細胞增殖及凋亡的影響，為其在臨床

4、上治療血管瘤提供理論依據。
　　第一部分平陽霉素誘導HUVEC細胞凋亡的作用機制
　　目的:檢測不同濃度平陽霉素(Pingyangmycin，PYM)作用24小時對人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC細胞的生長抑制及凋亡的影響，探討平陽霉素誘導HUVEC細胞凋亡最佳濃度及有關作用機制。
　　方法:用不同濃度的平陽霉素作用HUVEC細胞24小時，以細胞增殖-毒性8檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)

5、檢測比較0.1、1、10、100、1000μg/ml平陽霉素作用24小時后對HUVEC細胞的抑制作用，用膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin-Ⅴ FITC/PI apoptosis kit）檢測不同濃度PYM對HUVEC細胞凋亡作用的影響，蛋白質印跡法(Western blot)檢測不同濃度平陽霉素作用HUVEC細胞后內質網應激蛋白GRP78和CHOP的表達。
　　結果:CCK-8結果顯示隨平陽霉

6、素濃度的升高，對HUVEC細胞的抑制作用越明顯（P＜0.05）;然平陽霉素藥物濃度100μg/ml和1000μg/ml組相比，差異無顯著性統計學意義（P＞0.05）。流式細胞檢測顯示0.1、1、10、100μg/ml平陽霉素作用24小時后細胞凋亡率分別為(5.37±1.63)％、(12.7±1.57)％、(24.7±6.99)％、(23.6±0.80)％，壞死率分別為(4.87±2.09)％、(7.32±3.88)％、(39.1±6.1

7、8)％、(66.3±0.40)％，隨藥物濃度增加而增高，過高濃度細胞壞死占主導，和對照組相比，差異具有顯著性統計學意義(P＜0.05);Western blot結果顯示平陽霉素各濃度作用24 h后促進內質網應激蛋白GRP78和CHOP的表達。
　　結論:平陽霉素在體外能明顯抑制HUVEC細胞生長并促進其凋亡，當平陽霉素濃度達到100μg/ml時，細胞以壞死為主;平陽霉素可能通過內質網應激途徑誘導HUVEC細胞凋亡。
　　第二

8、部分平陽霉素聯合地塞米松對HUVEC細胞增殖和凋亡的影響
　　目的:探討平陽霉素(Pingyangmycin，PYM)聯合地塞米松(dexamethasone，DEX)對人臍靜脈血管內皮細胞系HUVEC細胞增殖和凋亡的的影響，為臨床上平陽霉素聯合地塞米松治療血管瘤提供理論依據。
　　方法:設置平陽霉素組、地塞米松組、平陽霉素聯合地塞米松組(聯合組A、B、C、D)，分別作用于體外培養(yǎng)HUVEC細胞24小時，倒置顯微鏡觀察細胞形

9、態(tài);細胞增殖-毒性8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測各組對HUVEC細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測HUVEC細胞的凋亡率;Western blot檢測HUVEC細胞凋亡蛋白caspase-3的表達情況。
　　結果:平陽霉素(0.1、1、10、100μg/ml)、地塞米松(0.1、1、10、100μg/ml)均能使貼壁細胞密度下降，變圓、變形的漂浮細胞增多，平陽霉素、地塞米松對HUVEC細胞的生長增殖均有明

10、顯的抑制作用，且呈濃度依賴性;當低濃度平陽霉素(≤10μg/ml)聯合地塞米松具有協同效應。流式細胞儀檢測結果顯示，與平陽霉素單獨作用比較，1μg/ml平陽霉素聯合地塞米松(0.1、1、10、100μg/ml)細胞凋亡率逐漸增加，差異有顯著性統計學意義(P＜0.05);Western blot檢測結果顯示，與平陽霉素單獨作用比較，1μg/ml平陽霉素聯合地塞米松(0.1、1、10、100μg/ml)作用細胞后caspase-3表達逐漸增