DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　各種肺內(nèi)外因素造成的低氧刺激均能影響血管內(nèi)膜、血管中層和血管外膜，并導(dǎo)致肺組織血管的病理改變和結(jié)構(gòu)重塑，最終引起肺循環(huán)負(fù)荷的增加和肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞襯于肺動(dòng)脈的最內(nèi)層，直接與血液接觸并感應(yīng)血流、血壓、氧含量和血液中各種因子的變化。目前認(rèn)可程度較高的一種假說(shuō)認(rèn)為，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷是肺動(dòng)脈高壓形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，研究低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制并尋找可靠的保護(hù)措施對(duì)低氧肺動(dòng)脈高壓防治具有特殊的意義。

2、　　中醫(yī)理論認(rèn)為丹參具有活血化瘀、理氣止痛的功效，臨床應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療。丹參素是中藥丹參根莖中的主要水溶性生物活性成分，丹參素冰片酯（Tanshinol borneol ester，DBZ）是按照中醫(yī)“君使”理論以丹參素和冰片酯化合成的丹參素衍生物；而丹參素異丙酯（IDHP）是利用代謝組學(xué)方法在復(fù)方丹參方(Salvia miltiorrhiza bunge)中發(fā)現(xiàn)的核心效應(yīng)成分；更為重要的是，DBZ和IDHP都是正在研究

3、的臨床前藥物。因此，明確DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用并探索其保護(hù)作用的機(jī)制，對(duì)于完善丹參素及其衍生物心血管保護(hù)理論和開(kāi)發(fā)新型心血管保護(hù)藥物具有指導(dǎo)意義。
　　研究目的：
　?。?）探討低氧刺激對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制；
　?。?）探討DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制；
　　（3）對(duì)比不同構(gòu)型的

4、DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用差異，明確保護(hù)作用最佳的藥物構(gòu)型。
　　研究意義：
　　本課題明確了低氧刺激造成 HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)展變化規(guī)律及其相互作用關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步明確了DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞氧化應(yīng)激、自噬和凋亡的保護(hù)作用，并明確干預(yù)效果最佳的藥物構(gòu)型。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　(1)單純低氧刺激實(shí)驗(yàn)分組：
　　對(duì)數(shù)

5、生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低氧刺激12 h、24 h、48 h或72 h組，低氧處理的細(xì)胞在含有1％氧氣的條件下培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清檢測(cè)T-SOD活性和MDA含量；收集細(xì)胞并提取蛋白檢測(cè)細(xì)胞中Trx-1、Txnip、Nrf2、Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、HIF-1α、BNIP3、BNIP3L、Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)。采用流式細(xì)胞技術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量的變

6、化、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況；采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測(cè)細(xì)胞中自噬體的生成量；采用JC-1探針檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)低氧刺激HUVEC細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位變化。
　　(2)低氧刺激并進(jìn)行藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)分組
　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Control）、低氧刺激24 h組（Hypoxia組）、低氧刺激+不同構(gòu)型 DBZ/IDHP組（Hypoxia+DBZ/IDHP組）、單純不同構(gòu)型DBZ/IDHP干預(yù)組（DBZ/

7、IDHP組）；培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清檢測(cè)T-SOD活性和MDA含量；收集細(xì)胞并提取蛋白檢測(cè)細(xì)胞中Trx-1、Txnip、Nrf2蛋白表達(dá)。
　　(3) HIF-1α siRNA對(duì)細(xì)胞自噬影響的研究實(shí)驗(yàn)分組
　　在HIF-1α siRNA干預(yù)HUVEC細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，我們將細(xì)胞在有或無(wú)HIF-1αsiRNA干預(yù)的情況下分為：空白對(duì)照組（Control），低氧刺激24 h、48 h和72 h組， HIF-1α si

8、RNA干預(yù)對(duì)照組和HIF-1α siRNA聯(lián)合低氧刺激24 h、48 h和72 h組；并在低氧刺激細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測(cè)細(xì)胞中自噬體的生成量；并提取細(xì)胞蛋白檢測(cè)Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)量。另外，在低氧刺激細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，采用流式細(xì)胞技術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　(4)3-MA或雷帕霉素干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡影響

9、的研究實(shí)驗(yàn)分組
　　將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和3-MA或雷帕霉素預(yù)處理的細(xì)胞分別隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、低氧（24h、48h、72h）處理組；并在低氧刺激細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測(cè)細(xì)胞中自噬體的生成量；并提取細(xì)胞蛋白檢測(cè)Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)量。并在低氧刺激細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，采用流式細(xì)胞技術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

10、>　　(5)不同構(gòu)型的DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞自噬的影響
　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)分為如下幾組：空白對(duì)照、單純低氧刺激組、低氧刺激+左旋體（S）藥物組、低氧刺激+右旋體（R）藥物組、低氧刺激+消旋體藥物組，以及三種構(gòu)型藥物的對(duì)照組。所有低氧刺激的細(xì)胞均在氧含量為1%的環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)，而后采用 LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測(cè)細(xì)胞中自噬體的生成；并提取細(xì)胞蛋白檢測(cè)Beclin-1、LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ的表

11、達(dá)量。在氧含量為1%的環(huán)境中培養(yǎng)72小時(shí)，而后采用流式細(xì)胞技術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；采用western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2等蛋白的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）含氧為1%的環(huán)境中培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞后細(xì)胞中MDA和ROS含量增加，T-SOD活性降低；同時(shí)伴有Trx-1、Nrf2蛋白表達(dá)的降低和Txnip蛋白表達(dá)的增加；并且，上述變化均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依

12、賴(lài)性。左旋、右旋和消旋體的DBZ及IDHP均能夠促進(jìn) Trx-1和 Nrf2的表達(dá)，抑制 Txnip蛋白的表達(dá)，最終降低低氧刺激24小時(shí)后HUVEC細(xì)胞中MDA的含量并增加T-SOD的活性。
　?。?）低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞中自噬體熒光強(qiáng)度增加，Beclin-1和LC-3Ⅱ蛋白表達(dá)量及C-3Ⅱ與LC-3Ⅰ表達(dá)量的比值都在低氧刺激24小時(shí)達(dá)到最高；另外，低氧刺激時(shí)間依賴(lài)性地增加HUVEC細(xì)胞中HIF-1α、BNIP3和BNIP3L

13、的蛋白表達(dá)。HIF-1αsiRNA及3-MA干預(yù)能夠抑制低氧刺激時(shí) HUVEC細(xì)胞中自噬體的生成和 Beclin-1及LC-3Ⅱ蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ表達(dá)量比值的增加，說(shuō)明HIF-1αsiRNA和3-MA能夠在一定程度上抑制低氧刺激引起的細(xì)胞自噬。不同構(gòu)型的DBZ和 IDHP都能夠促進(jìn)低氧刺激24小時(shí)后 HUVEC細(xì)胞中自噬體的生成，同時(shí)增加Beclin-1和LC-3Ⅱ蛋白，以及LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ表達(dá)量的比值。本

14、部分結(jié)果還提示，左旋體DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用最為強(qiáng)烈，右旋體次之，消旋體藥物的促進(jìn)作用最弱。3-MA預(yù)處理能夠在一定程度上抑制不同構(gòu)型DBZ和IDHP的上述作用。
　?。?）低氧刺激引起HUVEC細(xì)胞周期阻滯，在低氧刺激的前24小時(shí)表現(xiàn)為G2/M期阻滯，低氧刺激72小時(shí)表現(xiàn)為G0期阻滯；低氧刺激引起細(xì)胞凋亡，且隨著低氧刺激時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；并且，線(xiàn)粒體膜電位和Cyto-C、cleaved

15、 caspase-3、Bax和 Bcl-2等蛋白檢測(cè)結(jié)果表明低氧刺激通過(guò)線(xiàn)粒體相關(guān)途徑引起細(xì)胞凋亡。HIF-1α siRNA干預(yù)能夠減少低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞凋亡的數(shù)量，減少低氧刺激時(shí)Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加Bcl-2等抑制細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)；相反，3-MA干預(yù)后增加低氧刺激時(shí)HUVEC細(xì)胞凋亡的數(shù)量，同時(shí)促進(jìn)低氧刺激時(shí)低氧刺激時(shí)Cyto-C、cleaved caspase-

16、3和Bax等蛋白的表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)；然而，雷帕霉素則能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)揮與3-MA相反的作用。不同構(gòu)型的DBZ和IDHP都能夠減少低氧刺激72小時(shí)后HUVEC細(xì)胞的凋亡，同時(shí)Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，并增加Bcl-2等抑制細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。更為重要的是，本部分結(jié)果還提示，左旋體DBZ和IDHP對(duì)低氧刺激時(shí) HUVEC細(xì)胞凋亡的抑制作用最為強(qiáng)烈，右旋體次之，消旋體藥物