PFKFB3在高糖環(huán)境下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：作為糖尿病性視網(wǎng)膜病變分級(jí)的重要標(biāo)志性特征，新生血管是整個(gè)DR發(fā)展中的關(guān)鍵性事件，大量研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞依靠無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生能量來(lái)維持細(xì)胞功能，即形成“分支”，產(chǎn)生新生血管。但高血糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解對(duì)新生血管的作用機(jī)制仍不清楚，本研究將探討磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase3，PFKFB3)在高糖環(huán)境下對(duì)血管新生的可能作用

2、及其機(jī)制。
　　方法：研究主要分為五個(gè)部分：第一部分采用正常糖(5mmol/L glucose，NG)和高糖(30mmol/L glucose，HG)分別培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)24h后，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot，WB)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR

3、)檢測(cè)正常糖和高糖環(huán)境下PFKFB3的表達(dá);第二部分采用正常糖(5mmol/L glucose，NG)、正常糖加SiRNA-1(NG+SiRNA-1)、正常糖加SiRNA-2(NG+SiRNA-2)和正常糖加SiRNA-3(NG+SiRNA-3)轉(zhuǎn)染HUVECs后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，采用WB方法檢測(cè)每組中PFKFB3的表達(dá)。第三部分采用正常糖(NG)、正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA

4、)培養(yǎng)HUVECs后，分別將每組中的HUVECs加入對(duì)應(yīng)的基質(zhì)膠中繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行照相，最后采用ImageJangiogenesis軟件對(duì)每組進(jìn)行管腔形成能力檢測(cè)。第四部分采用正常糖(NG)和正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)培養(yǎng)HUVECs，采用WB方法檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylation Protein kinase B，pAkt)及蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB or Akt)的表達(dá)

5、。第五部分采用正常糖(NG)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA)培養(yǎng)HUVECs，采用WB方法檢測(cè)pAkt及Akt的表達(dá)。
　　結(jié)果：第一部分高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs相較于正常糖環(huán)境下的PFKFB3蛋白表達(dá)明顯升高(t=5.457，P=0.000，P＜0.01)，且高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs相較于正常糖環(huán)境下的PFKFB3mRNA表達(dá)也明顯升高(t=4.466，P=0.000，P＜0.01);第二部分SiRN

6、A-1對(duì)于PFKFB3的抑制效果最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P＜0.01);第三部分高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs的管腔形成能力是明顯低于正常對(duì)照組的(P=0.005，P＜0.01)，正常糖加入SiRNA的管腔形成能力相較于對(duì)照組來(lái)說(shuō)也是明顯升高的(P=0.031，P＜0.05)，高糖培養(yǎng)基中加入SiRNA的管腔形成能力相較于單純高糖培養(yǎng)基的管腔形成能力是明顯增加的(P=0.041，P＜0.05)，正常對(duì)照組與高糖培養(yǎng)基

7、中加入SiRNA相比較則沒(méi)有明顯差異(P=0.173，P＞0.05);第四部分正常糖培養(yǎng)基中加入SiRNA抑制PFKFB3后，HUVECs的pAkt的表達(dá)量相較于單純正常糖培養(yǎng)基中明顯減少(t=16.91，P=0.00，P＜0.01);第五部分正常糖培養(yǎng)基組中的pAkt表達(dá)明顯高于高糖培養(yǎng)基組(P=0.004，P＜0.01)，高糖培養(yǎng)基加入SiRNA組中pAkt表達(dá)明顯高于高糖培養(yǎng)基組(P=0.000，P＜0.01)，當(dāng)高糖培養(yǎng)基中加入