CREG抑制高糖高脂誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的機制研究-.pdf

1、研究背景和目的：糖尿?。―M)大血管并發(fā)癥（如冠狀動脈疾病、周圍血管疾病、中風）是2型糖尿?。═2DM)患者的主要死亡原因，超過D M相關死亡的50％。D M大血管并發(fā)癥的特點是加速的動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。DM和非DM個體動脈粥樣硬化在病理解剖上是相似的，但 DM病變發(fā)生更早，波及范圍更廣泛。越來越多的證據(jù)表明，血管內(nèi)皮功能障礙和細胞凋亡是DM患者動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中最早和最關鍵的始動因素。D M患者血管內(nèi)皮細胞（ECs)暴露于

2、高血糖和高脂環(huán)境從而發(fā)生凋亡并從內(nèi)膜脫落，觸發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生，導致動脈粥樣硬化進展和大血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。雖然ECs凋亡和動脈粥樣硬化之間的因果關系已形成共識，但其潛在機制仍不完全清楚。因此，闡明內(nèi)皮細胞凋亡信號通路，有助于我們尋找減少D M患者ECs凋亡和動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的新的治療靶點。
　　E1A激活基因阻遏子（CREG)是一種小分子糖蛋白，主要表達于分化成熟的組織細胞，在未分化的組織細胞低表達甚至不表達。有研究報

3、道，在分化成熟型血管平滑肌細胞（VSMCs)中CREG大量表達，通過抑制VSMCs增殖、遷移并誘導其分化來維持VSMCs的穩(wěn)態(tài)，提示CREG是一個誘導細胞分化的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調控因子。本實驗室前期一系列研究結果提示：CREG在正常血管ECs中存在高表達，小鼠主動脈和人冠狀動脈動脈粥樣硬化斑塊部位ECs中CREG的表達顯著減少；通過皮下埋泵方式給予高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠外源性的CREG蛋白，則可明顯減輕動脈粥樣硬化斑塊。進一步研究發(fā)現(xiàn)，

4、CREG可能通過下述機制保護血管ECs:①通過不同的信號通路促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs)的增殖和遷移；②在豬冠狀動脈損傷模型中，給予CREG蛋白涂層支架可促進冠狀動脈內(nèi)皮修復；③通過抑制NF-kappaB的激活和抑制腫瘤壞死因子a(等細胞因子刺激引起的ECs超滲透性炎癥反應；④通過VEGF/PI3K/Akt通路抑制凋亡誘導劑引起的ECs凋亡等。綜上所述，CREG 是對抗ECs凋亡、保護血管ECs完整性的重要調控因子。除

5、了對ECs的保護作用，CREG基因還具有抑制VSMC和骨髓干細胞凋亡的作用。然而，CREG在D M患者ECs凋亡中的作用尚不清楚，結合本實驗室前期研究，我們擬探討動脈粥樣硬化病理因素高糖高脂刺激下CREG基因表達與ECs凋亡變化以及引起CREG表達變化的上游調控機制。
　　研究方法：
　　1.經(jīng)沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選 DM合并下肢動脈硬化需進行截肢手術的病人（DM組）及因交通事故等外傷需截肢的非DM非動脈粥樣

6、硬化患者(對照組）。分離截肢部位動脈，通過 HE染色、免疫熒光染色及原位末端標記法(TUNEL)觀察 DM組及對照組血管E C s凋亡及人CREG(hCREG)基因表達情況，并通過Western b lo t檢測兩組血管中hCREG表達及調亡執(zhí)行分子Cleaved caspase-3的表達情況。原代培養(yǎng)HUVECs，給予不同濃度（5.5mM、11.1mM、25m M和33.3mM) D-葡萄糖（D-GLU)及不同濃度（0.2mM、0.3

7、mM、0.4mM)棕櫚酸（PA)處理24h，模擬T2 D M細胞模型，應用Annexin V-F IT C/P I和 T U N E L染色檢測細胞調亡情況， Western b l o t及實時焚光定量多聚酶鏈式反應（PCR)檢測 hCREG基因及 Cleaved caspase-3表達，并明確誘導 HUVECs凋亡的最佳高糖高脂濃度。構建低表達和過表達hCREG基因的HUVECs，篩選穩(wěn)定轉染細胞并建立細胞系，分別給予高糖高脂刺激2

8、4h，通過Annexin V-FITC/PI, TUNEL染色及Western b lo t檢測細胞調亡及hCREG、Cleaved caspase-3表達情況，進一步證實高糖高脂環(huán)境下HUVECs中hCREG基因表達與細胞凋亡的關系。
　　2.通過生物信息學（N C B I的GenBank)初步預測hCREG啟動子區(qū)位置，構建包含 hCREG基因啟動子區(qū)不同截短片段的雙熒光素酶報告基因及增強綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因，通過

9、檢測焚光素酶活性及觀察綠色熒光強度確定h C R E G基因核心啟動子區(qū)位置。再結合轉錄因子（TF)基因芯片篩查、生物信息學預測（Promo在線預測軟件）、染色質免疫共沉淀（ChIP)等實驗，確定hCREG核心啟動子區(qū)可能結合的TF。
　　3.缺失突變TF可能與hCREG基因結合的位點，構建含缺失突變位點的雙熒光素酶報告基因，與未突變的報告基因相比活性有明顯差異的位點即為對hCREG起關鍵調控作用的TF結合位點。提取D M患者動脈

10、粥樣硬化血管與正常對照血管RNA及蛋白，通過定量PCR和 Western b lo t檢測該T F的表達，明確與hCREG表達的相關性。構建過表達該T F的 pcDNA3.1(+)載體，通過 Annexin V-FITC/PI、T U N E L染色及Western blot檢測過表達該TF對高糖高脂誘導的HUVECs中hCREG表達及細胞凋亡的影響。明確該T F對高糖高脂環(huán)境下hCREG基因表達的調控作用。
　　研允結果：

11、>　　1. D M患者血管ECs和高糖高脂刺激下的HUVECs中hCREG基因表達減少，ECs凋亡增加。
　　H E染色可見，D M血管內(nèi)膜明顯增厚，斑塊突入管腔；免疫熒光染色顯示， D M組血管內(nèi)皮中hCREG基因表達較對照組血管明顯減少，TUNEL染色顯示D M組血管比對照組血管ECs凋亡明顯增多。Western blot檢測可見D M血管hCREG表達明顯減少而Cleaved caspase-3的表達明顯增多，提示h C R

12、 E G可能參與了 D M患者血管ECs凋亡的過程。
　　首先確定25m M的D-G LU為最佳高糖刺激濃度，可使HUVECs凋亡顯著增多但細胞死亡無明顯增多。Annexin V-F IT C/P I和 T U N E L染色檢測顯示高糖（25mM D-G L U)加不同濃度高脂（0.2、0.3、0.4mM P A)刺激24 h后隨P A濃度增高，HUVECs凋亡呈劑量依賴性增加。Western blot及定量PCR結果顯示hCR

13、EG基因表達隨高脂濃度增高呈劑量依賴性減少，而 Cleaved caspase-3明顯增多，即調亡增加。此部分實驗顯示高糖高脂刺激可引起HUVECs中hCREG基因表達減少，細胞凋亡增加。
　　為進一步明確hCREG基因在高糖高脂誘導的HUVECs凋亡中的作用，構建了低表達和過表達hCREG基因的HUVECs，篩選穩(wěn)定轉染的細胞并建立細胞系，分別給予高糖高脂刺激24h，通過Western blot、定量PCR、Annexin V-

14、FITC/PI和 TUNEL染色檢測，結果顯示過表達hCREG可以明顯減輕高糖高脂誘導的HUVECs凋亡，而低表達hCREG可加重HUVECs凋亡。提示hCREG是高糖高脂條件下血管ECs凋亡增加的直接原因。
　　以上組織學和細胞學實驗均表明，高糖高脂環(huán)境下通過下調hCREG基因表達可以引起HUVECs凋亡增加。調控基因表達最關鍵的環(huán)節(jié)是轉錄水平的調控，其中順式作用元件（主要指啟動子）與反式作用因子（如 TF)是兩個基本的轉錄調控

15、元件。目前 hCREG基因核心啟動子區(qū)定位和調控其表達的T F尚不清楚。
　　2. hCREG基因核心啟動子區(qū)的確立和關鍵T F的篩選
　　通過生物學（N C B I的GenBank)預測hCREG啟動子區(qū)位于轉錄起始位點（定義為+1)上游約2000bp范圍內(nèi)，構建包含hCREG基因啟動子區(qū)不同截短片段的雙熒光素酶報告基因 pGL4.12-hCREG-2003(-1925/+78)、pGL4.12-hCREG-945 C-8

16、67/+78)、pGL4.12-hCREG-586(-508/+78)、 pGL4.12-hCREG-478(-400/+78)和pGL4.12-hCREG-358(-280/+78)，將這些質粒分別與參照質粒pGL4.73共轉染于人胚胎腎上皮293T和 HUVECs48h，按照雙熒光素報告基因系統(tǒng)操作說明書，檢測熒火蟲焚光素酶（Firefly luciferase，F(xiàn)luc)與海腎素焚光素酶活性（Renila luciferase，R

17、luc)。首次確定了 h C R E G基因高水平轉錄的最小核心啟動子區(qū)域位于hCREG-568(-508/+78)片段；而 hCREG-586(-508/+78)和 hCREG-358(-280/+78)之間熒光素酶活性出現(xiàn)較大落差，提示-508/-281片段在hCREG基因表達中起關鍵調控作用。另外分別構建pEGFP1綠色熒光報告基因pEGFP1-hCREG-2003、pEGFP1-hCREG-945、pEGFP1-hCREG-58

18、6^pEGFP1-hCREG-478和 pEGFP1-hCREG-358系列報告基因載體，轉染293T細胞后直接在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光轉染效率和強度，得到相似結果?；谝陨辖Y果，合成hCREG基因-508/+78的D N A片段，通過T F基因芯片篩查、生物信息學預測(P ro m o在線預測軟件）、C h IP實驗等確定了核心啟動子區(qū)域hCREG-586(-508/-281)最有可能結合的TF有 GATA1和ETS1。
　　

19、3.過表達GATA1可以通過上調hCREG表達而減少高糖高脂誘導的HUVECs凋亡。
　　通過缺失突變方法確定了對hCREG起關鍵調控作用的TF為GATA1，其與hCREG的結合位點位于-297/-292。將此位點缺失突變后，hCREG基因轉錄活性降低約83.3%。而 GATA1(-467/-462)及 ETS1(-312/-306)缺失突變前后hCREG基因轉錄活性無明顯變化。提取DM患者動脈粥樣硬化血管與對照血管，通過定量P

20、C R和 Western b lo t檢測發(fā)現(xiàn)D M患者血管中GATA1明顯減少，與hCREG基因表達成正相關。
　　為了更進一步驗證GATA1對 hCREG的調控作用，構建了 pcDNA3.1(+)過表達G A T A1穩(wěn)定轉染的H U V E C s細胞模型，給予高糖高脂刺激24h，Annexin V-FITC/PI和 TUNEL染色結果發(fā)現(xiàn)，過表達GATA1后高糖高脂誘導的HUVECs凋亡減少47%和21%，均有顯著差異。定

21、量PCR和 Western b lo t檢測結果則表明，過表達GATA1后 hCREG表達上調2?4倍。
　　本部分的研究結果提示GATA1是上調hCREG表達的關鍵上游調控分子，GATA1過表達可以通過上調hCREG表達，對抗高糖高脂誘導的血管ECs凋亡。
　　結論：綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：①T2DM患者動脈粥樣硬化血管比非D M患者血管內(nèi)皮細胞中hCREG基因表達減少而細胞凋亡明顯增多；②高糖（25 mM D-GLU)加不

22、同濃度高脂（0.2、0.3、0.4mM P A)刺激24 h后，隨高脂濃度增高H U V E C s凋亡呈劑量依賴性增多，hCREG基因表達呈劑量依賴性減少。③過表達hCREG基因可以使高糖高脂誘導的HUVECs凋亡減少，而低表達hCREG基因可以使高糖高脂誘導的HUVECs凋亡進一步增加；④研究表明，hCREG基因關鍵啟動子區(qū)位于-508/+78，GATA1可能與該區(qū)內(nèi)-297/-292位點結合，將此位點缺失突變后，C R E G基因